引用本文： 李淼, 白玉龍, 潘小亮, 汪晶晶, 陳維明, 駱井萬, 胡凱, 陳金發. 脫鈣骨基質中BMP-2含量與其體內/外成骨活性的相關性研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(5): 620-626. doi: 10.7507/1002-1892.202012006 復制
骨缺損修復與重建一直是臨床研究的重點。自體骨移植被認為是治療骨缺損的金標準，但來源受限是其最大不足。同種異體骨是自體骨理想替代材料[1-3]，其來源相對廣泛，具有良好的生物相容性和骨誘導活性，已廣泛用于臨床硬組織修復[4]。自 20 世紀 60 年代 Urist 在同種異體骨中發現了BMP-2 后，BMP-2 得到越來越多研究關注[5-6]。BMP-2 是一種多功能生長因子，屬于 TGF-β 超家族，在刺激成骨分化的骨誘導過程中扮演著重要角色。臨床前和臨床研究均表明，BMP-2 可用于各種治療性干預措施，例如骨缺損、不愈合骨折、脊柱融合、骨質疏松癥的治療及根管治療術[5, 7-9]。
脫鈣骨基質（demineralized bone matrix，DBM）是目前臨床常用的一種同種異體骨移植材料，脫鈣處理可以使骨組織中的 BMP-2 蛋白暴露，提高材料的成骨活性。目前，常用的同種異體 DBM 成骨能力評價方法為裸鼠體內異位成骨誘導實驗[10]，耗時較長，不適用于組織庫和同種異體骨生產型企業，因此需要尋求一種科學、簡易的評價方法。本研究通過 4 種方法提取 DBM 中 BMP-2，檢測材料中 BMP-2 含量，并通過體外及體內實驗評價材料成骨活性，探討 DBM 中 BMP-2 含量與其成骨活性的相關性，以期尋找一種簡易、便捷評價 DBM 成骨活性的方法。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
9 具人尸體左側股骨中段標本用于制備 DBM，由上海亞朋生物技術有限公司提供。小鼠胚胎成骨細胞 MC3T3-E1 由上海生命科學研究院細胞中心提供。BALB/c 雄性裸小鼠 30 只，體質量（25±5）g，由北京大學口腔醫院動物實驗室提供，手術及取材均在動物實驗室完成。
10% 中性甲醛（南昌雨露實驗器材有限公司）；Ⅰ型膠原酶、氨基己酸、MTT、磷酸對硝基苯酯（p-nitrophenyl phosphate，pNPP）、DMSO（Sigma 公司，美國）；Tris-HCl、RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑（上海碧云天生物技術有限公司）；乙二胺四乙酸、Triton X-100（國藥集團化學試劑有限公司）；苯甲脒鹽酸鹽（Adamas 公司，瑞士）；青霉素/鏈霉素（GIBCO 公司，美國）；PBS（浙江天杭生物科技股份有限公司）；α-MEM 培養基、0.25% 胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；人 BMP-2 ELISA 試劑盒、BCA 蛋白質測定試劑盒（上海優選生物科技有限公司）；DAPI（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；多聚甲醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；TESCA 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）。
LT-100 連續投料粉碎機（北京興時利和科技發展有限公司）；KQ250B 型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；EG1150 H 病理組織包埋機（Leica 公司，德國）；BX50 熒光顯微鏡、IX71 倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；倒置顯微鏡（Nikon 公司，日本）；CO2 培養箱（濟南鑫貝生物技術有限公司）；酶標儀（Tecan 公司，瑞士）；高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。
1.2 DBM 制備
將 9 具股骨標本解凍、去除軟組織，制備成大小為 5 mm×10 mm×20 mm 骨塊；高壓沖洗后晾干，置于粉碎機中低溫保護粉碎；篩選粒徑為 0.1～1.0 mm 顆粒，脫脂處理并晾干后進行脫鈣操作。具體脫鈣方法：① 濃鹽酸與純化水按照體積比（V/V）1∶20 配置成稀鹽酸作為脫鈣液。② 將骨顆粒與脫鈣液按照質量比（W/W）1∶20 加入錐形瓶中，置于恒溫搖床上，以 25℃、180 r/min 條件脫鈣處理 24 h；③ 取出骨顆粒，以純化水洗去殘留脫鈣液，冷凍干燥 48 h，獲得 DBM。9 具標本獲得的 DBM 分別標記為 S1～S9，PA/PE 尼龍袋分裝，3 層密封，60Co 輻照滅菌（劑量 25 kGy）。取任一 S1～S9 DBM 置于高壓滅菌鍋內，于 121℃ 處理 30 min 進行滅活處理。
1.3 BMP-2 提取及檢測
取 S1～S9 DBM 標本以及滅活 DBM 標本（對照），分別采用 4 種方法提取 BMP-2 后，參照人 BMP-2 ELISA 試劑盒說明書檢測提取的 BMP-2 含量。每個樣品設置 6 個復孔。
① 蛋白酶抑制劑法：將 0.2 g DBM 樣品置于 1 mL 添加蛋白酶抑制劑的 Tris-HCl 溶液，于 4℃ 靜置 2 h，將混合物以離心半徑 8.5 cm、12 000 r/min離心 10 min，將上清液置于–80℃ 條件下儲存待檢測。
② 膠原酶法：將 0.2 g DBM 樣品置于 1.5 mL EP 管中，加入 1 mL 0.2 mol/L Tris-HCl 溶液，于 37℃ 溫育 2 h；加入 TESCA 緩沖液配置的Ⅰ型膠原酶溶液，于 37℃ 水浴中孵育過夜；以離心半徑 8.5 cm、12 000 r/min 離心 20 min。將上清液于 4℃ 條件下超濾透析純化蛋白，?80℃ 條件下儲存待檢測[11-12]。
③ 鹽酸胍/EDTA 法：將 30 mg DBM 樣品置于含 5 mmol/L 苯甲脒鹽酸鹽、1 mmol/L 苯甲基磺酰和 0.1 mmol/L 氨基己酸的鹽酸胍/EDTA 溶液（Tris 配置，pH7.4）。于 4℃ 水溶液中透析 72 h，每 24 小時更換 1 次透析液。取透析袋內混合物以離心半徑 8.5 cm、12 000 r/min 離心 10 min；取上清液保存于?80℃ 待檢測[13-14]。
④ RIPA 裂解液法：將 0.1 g DBM 樣品置于 1.5 mL EP 管中，加入 1 mL RIPA 裂解液以及 10 μL 蛋白酶抑制劑、10 μL 0.1 mmol/L EDTA 溶液，于 4℃ 條件下吹打混合物直至組織裂解。然后，以離心半徑 8.5 cm、12 000 r/min 離心 20 min；取上清液保存于?80℃ 待檢測。
1.4 體外成骨性能評價
1.4.1 DBM 與成骨細胞共培養
將 MC3T3-E1 細胞置于含 1% 青霉素/鏈霉素和 10%FBS 的 α-MEM 培養基中，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。每隔 1 d 換液，待細胞融合約 90% 時進行傳代，取第 3 代細胞進行實驗。采用 0.25% 胰蛋白酶溶液消化細胞，調整細胞濃度為 5.0×104個/mL。S1～S9 DBM 骨粉（S1～S9 組）以及滅活 DBM 骨粉（對照組）各取 1 mg，分別加入 24 孔培養板中，每孔加入 1.5 mL 細胞懸液，置于 37℃ 培養箱中培養。
1.4.2 觀測方法
① MTT 法檢測細胞增殖：共培養 1、4、7 d 后，每組各取 3 孔，分別加入 600 μL 5 mg/mL MTT，于 37℃ 放置 4 h；棄去 MTT 并加入 400 μL DMSO 振蕩 10 min；酶標儀測量 492 nm 處吸光度（A）值。
② 熒光染色觀察：共培養 7 d 后每組取 3 孔，PBS 溶液洗滌 2 次去除未貼壁細胞；將貼壁細胞置于 4% 多聚甲醛固定 40 min，PBS 溶液沖洗 3 次；DAPI 對細胞核進行染色。倒置熒光顯微鏡下觀察染色的細胞核。
③ ALP 活性檢測：共培養 7、14 d，每組各取 3 孔，?20℃ 下加入 0.2%Triton X-100 裂解細胞 10 min，置于 4℃ 冰箱裂解 1 h；吹打細胞懸液，于 4℃ 以離心半徑 8.5 cm、10 000 r/min 離心 10 min；取上清液與 100 μL 1 mg/mL pNPP 反應溶液混合，于 37℃ 反應 30 min。通過測量 405 nm 波長處A值確定 MC3T3-E1 細胞 ALP 活性，使用 BCA 蛋白質測定試劑盒在 562 nm 波長處測定總蛋白質含量。用總蛋白質濃度將 ALP 的相對活性進行標準化。
1.5 體內異位成骨誘導實驗
1.5.1 實驗分組及方法
將 30 只 BALB/c 雄性裸小鼠分為 10 組，分別為 S1～S9 DBM 組（S1～S9 組）以及滅活 DBM 組（對照組），每組 3 只。各組裸小鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉（0.2 mL/只）麻醉后，分別于雙側后肢大腿中部制備肌袋，根據分組每個肌袋植入對應 0.1 mL DBM 樣品。
1.5.2 組織學觀察
術后 4 周處死全部裸小鼠，取植入材料及其周圍組織，固定、脫鈣、包埋、切片（片厚 5 μm），常規 HE 染色后進行組織學觀察，評價新骨形成情況。新骨形成參照 “YY/T 1680-2020 同種異體修復材料脫礦骨材料的體內成骨誘導性能評價”[15]中的組織學結果評定標準進行半定量評價。由 2 個研究人員獨立盲評并統計。
1.6 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMP-2 含量檢測
4 種方法從 DBM 中提取的 BMP-2 檢測結果見圖 1。其中，鹽酸胍/EDTA 法 BMP-2 提取效率最高，蛋白酶抑制劑法最低。而且，不同供體制備的 DBM 中 BMP-2 含量差異較大，其中材料 S4 的 BMP-2 含量最高（平均 64.67 ng/g），其次為 S6（平均 52.35 ng/g）、S1（平均 37.23 ng/g）、S3（平均27.84 ng/g）、S2（平均 27.63 ng/g）、S5（平均 20.63 ng/g）、S8（平均 16.26 ng/g）、S7（平均 9.26 ng/g）、S9（平均 6.33 ng/g）。滅活 DBM 的 BMP-2 含量（平均 1.34 ng/g）明顯低于上述未滅活 DBM。其中滅活 DBM 以及 S7、S8、S9 材料的 BMP-2 含量均低于 20 ng/g。
圖1
S1～S9 以及滅活 DBM 經 4 種方法提取的 BMP-2 含量 比較
Figure1.
Comparison of BMP-2 contents extracted by 4 methods for S1-S9 and inactivated DBMs
2.2 體外成骨性能評價
2.2.1 MTT 法檢測細胞增殖
共培養后各組細胞A值均逐漸增加。其中，共培養 1 d，與對照組比較，S1、S2、S3、S4、S6 組A值明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）；與 S4 組相比，S5、S7、S8、S9 組A值明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。4 d 時，與對照組比較，S4、S6 組明顯增高（P<0.05）；并且 S4 組明顯高于其他 DBM 組（P<0.05）。7 d 時，與對照組比較，S1～S6 組A值均明顯增高（P<0.05），且 S4 組明顯高于其他 DBM 組（P<0.05）。見圖 2。
圖2
MTT 法檢測 MC3T3-E1 細胞與不同 DBM 共培養 1、4、 7 d 增殖情況
Figure2.
The proliferations of MC3T3-E1 cells co-cultured with different DBMs for 1, 4, and 7 days by MTT method
2.2.2 熒光染色觀察
倒置熒光顯微鏡下觀察，共培養 7 d 后各組成骨細胞均狀態良好，可見絲狀偽足，其中 S1、S2、S3、S4、S6 組成骨細胞多于其他組，且 S4 組成骨細胞最多。見圖 3。
圖3
各組熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
a. 對照組；b～j. S1～S9 組
Figure3. Fluorescence staining observation of each group (Inverted fluorescence microscope×100)a. Control group; b-j. S1-S9 groups
2.2.3 ALP 活性檢測
共培養 7 d 時，與對照組比較，S1、S2、S3、S4、S6 組 ALP 活性明顯增高（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。14 d 時，與對照組比較，S4、S6 組 ALP 進一步增加（P<0.05），且 S4、S6 組間差異無統計學意義（P>0.05）；與 S4 組比較，S7、S8、S9 組 ALP 明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
共培養 7 d 及 14 d 各組 ALP 活性檢測
Figure4.
ALP activity in each group for 7 and 14 days of co-cultivation
2.3 體內異位成骨誘導實驗
術后 4 周，HE 染色觀察見對照組植骨區域新生骨較少。各 DBM 組中，BMP-2 含量較高的 S1～S6 組植骨區域均可見軟骨和新骨生成，并且隨著 BMP-2 含量增加，材料的成骨活性越好，材料邊緣的腔隙內可觀察到越多的新骨生成；S4、S6 組骨新生區域含有大量軟骨細胞和成骨細胞。見圖 5。
圖5
術后 4 周各組 HE 染色觀察（左：×100，右：×200）
a. 對照組；b～j. S1～S9 組
Figure5. HE staining in each group at 4 weeks after operation (Left: ×100, right: ×200)a. Control group; b-j. S1-S9 groups
半定量分析顯示，對照組新骨形成評分為 1 分。與對照組比較，S1～S6 組新骨形成評分明顯增高（P<0.05），S7、S8、S9 組評分無明顯差異（P>0.05），表明 S7、S8、S9 組無成骨活性。見圖 6。
圖6
術后 4 周各組組織學觀察半定量評分
Figure6.
Semi-quantitative score of histological observation in each group at 4 weeks after operation
3 討論
研究者普遍認為 DBM 中的 BMP-2 是誘導體內異位成骨的主要因素，因此可通過直接檢測 BMP-2 含量間接評估 DBM 產品體內成骨活性，是一種快速、便捷的方法。目前，BMP-2 提取方法主要有膠原酶法、蛋白酶抑制劑法、鹽酸胍/EDTA 法和 RIPA 裂解液法。本研究顯示上述 4 種方法的 BMP-2 提取效率差異較大，其中鹽酸胍/EDTA 法效率最高，分析與 BMP 蛋白是一種酸性多肽，不溶于水，可溶于中性鹽溶液，尤其是鹽酸胍溶液中有關。為此，Cook[16]的研究選擇將 BMP 溶于鹽酸胍溶液后，直接注入新鮮骨折模型中。但是上述 BMP-2 提取方法存在需脫鈣、浸提處理以及長時間暴露于體外等問題，造成 BMP-2 蛋白失活，因此不能準確反映 DBM 中的真實 BMP-2 含量，故通過單純 BMP-2 定量檢測評價 DBM 成骨活性具有一定局限性。
相比體內異位成骨實驗，體外細胞實驗是一種經濟的評價 DBM 活性方法。BMP-2 是一種包含 396 個氨基酸的多肽生長因子，可誘導未分化的 MSCs 形成軟骨和骨組織，促進成骨細胞增殖[17-18]，是促進成骨分化能力最強的細胞因子[19-20]，以此促使成骨細胞 ALP 表達升高。而且細胞對 BMP-2 的刺激具有較高敏感性，可以精確反映不同骨組織中 BMP-2 含量的微小差異。但是，目前尚無證據表明 BMP-2 含量與細胞增殖分化和 ALP 活性具有劑量關系。本研究發現隨著 DBM 中 BMP-2 含量升高，共培養的成骨細胞增殖能力也越強。當成骨細胞與 DBM 材料共培養 7 d，BMP-2 含量低于 20 ng/mg 的 DBM 樣品 S7、S8、S9 中共培養的細胞增殖能力較差，與滅活 DBM 相比無顯著差異。該結果與 14 d 時 ALP 表達檢測結果相對應。
體內異位成骨實驗能夠直接且全面地評價材料成骨活性。本研究結果提示，隨著 DBM 中 BMP-2 含量升高，其體內成骨活性也越強。其中 BMP-2 含量最高的DBM S4 表面有大量成骨細胞吸附，成骨最活躍，表現出最佳成骨活性，新骨形成評分也最高。相對而言，BMP-2 含量較低的 S7、S8 及 S9 成骨活性較差，與滅活 DBM 相比無顯著性差異，新骨形成評分也較低。體內的異位成骨實驗結果與體外細胞實驗以及 BMP-2 定量結果相對應，體現出三者的相關性。
綜上述，BMP-2 含量會顯著影響 DBM 成骨活性。當 BMP-2 含量>20.63 ng/g 時，DBM 成骨活性較好；<16.26 ng/g 時，DBM 在體內及體外均不具備骨誘導能力。這為組織庫或同種異體骨生產企業評價 DBM 產品提供了新的思路。然而本研究樣本量較少，對于通過 BMP-2 定量檢測和體外成骨細胞增殖分化實驗評估 DBM 成骨活性的準確度，有待進一步探究。
作者貢獻：李淼直接參與DBM制備、BMP-2提取及檢測、體外細胞實驗以及數據收集和文章撰寫；潘小亮參與DBM制備；汪晶晶、陳維明、駱井萬、胡凱參與動物實驗；白玉龍、陳金發提供實驗設計思路并把控實驗實施、文章修改并，對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經北京大學生物醫學倫理委員會實驗動物福利倫理分會委員批準（LA2019019）。
骨缺損修復與重建一直是臨床研究的重點。自體骨移植被認為是治療骨缺損的金標準，但來源受限是其最大不足。同種異體骨是自體骨理想替代材料[1-3]，其來源相對廣泛，具有良好的生物相容性和骨誘導活性，已廣泛用于臨床硬組織修復[4]。自 20 世紀 60 年代 Urist 在同種異體骨中發現了BMP-2 后，BMP-2 得到越來越多研究關注[5-6]。BMP-2 是一種多功能生長因子，屬于 TGF-β 超家族，在刺激成骨分化的骨誘導過程中扮演著重要角色。臨床前和臨床研究均表明，BMP-2 可用于各種治療性干預措施，例如骨缺損、不愈合骨折、脊柱融合、骨質疏松癥的治療及根管治療術[5, 7-9]。
脫鈣骨基質（demineralized bone matrix，DBM）是目前臨床常用的一種同種異體骨移植材料，脫鈣處理可以使骨組織中的 BMP-2 蛋白暴露，提高材料的成骨活性。目前，常用的同種異體 DBM 成骨能力評價方法為裸鼠體內異位成骨誘導實驗[10]，耗時較長，不適用于組織庫和同種異體骨生產型企業，因此需要尋求一種科學、簡易的評價方法。本研究通過 4 種方法提取 DBM 中 BMP-2，檢測材料中 BMP-2 含量，并通過體外及體內實驗評價材料成骨活性，探討 DBM 中 BMP-2 含量與其成骨活性的相關性，以期尋找一種簡易、便捷評價 DBM 成骨活性的方法。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
9 具人尸體左側股骨中段標本用于制備 DBM，由上海亞朋生物技術有限公司提供。小鼠胚胎成骨細胞 MC3T3-E1 由上海生命科學研究院細胞中心提供。BALB/c 雄性裸小鼠 30 只，體質量（25±5）g，由北京大學口腔醫院動物實驗室提供，手術及取材均在動物實驗室完成。
10% 中性甲醛（南昌雨露實驗器材有限公司）；Ⅰ型膠原酶、氨基己酸、MTT、磷酸對硝基苯酯（p-nitrophenyl phosphate，pNPP）、DMSO（Sigma 公司，美國）；Tris-HCl、RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑（上海碧云天生物技術有限公司）；乙二胺四乙酸、Triton X-100（國藥集團化學試劑有限公司）；苯甲脒鹽酸鹽（Adamas 公司，瑞士）；青霉素/鏈霉素（GIBCO 公司，美國）；PBS（浙江天杭生物科技股份有限公司）；α-MEM 培養基、0.25% 胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；人 BMP-2 ELISA 試劑盒、BCA 蛋白質測定試劑盒（上海優選生物科技有限公司）；DAPI（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；多聚甲醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；TESCA 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）。
LT-100 連續投料粉碎機（北京興時利和科技發展有限公司）；KQ250B 型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；EG1150 H 病理組織包埋機（Leica 公司，德國）；BX50 熒光顯微鏡、IX71 倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；倒置顯微鏡（Nikon 公司，日本）；CO2 培養箱（濟南鑫貝生物技術有限公司）；酶標儀（Tecan 公司，瑞士）；高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。
1.2 DBM 制備
將 9 具股骨標本解凍、去除軟組織，制備成大小為 5 mm×10 mm×20 mm 骨塊；高壓沖洗后晾干，置于粉碎機中低溫保護粉碎；篩選粒徑為 0.1～1.0 mm 顆粒，脫脂處理并晾干后進行脫鈣操作。具體脫鈣方法：① 濃鹽酸與純化水按照體積比（V/V）1∶20 配置成稀鹽酸作為脫鈣液。② 將骨顆粒與脫鈣液按照質量比（W/W）1∶20 加入錐形瓶中，置于恒溫搖床上，以 25℃、180 r/min 條件脫鈣處理 24 h；③ 取出骨顆粒，以純化水洗去殘留脫鈣液，冷凍干燥 48 h，獲得 DBM。9 具標本獲得的 DBM 分別標記為 S1～S9，PA/PE 尼龍袋分裝，3 層密封，60Co 輻照滅菌（劑量 25 kGy）。取任一 S1～S9 DBM 置于高壓滅菌鍋內，于 121℃ 處理 30 min 進行滅活處理。
1.3 BMP-2 提取及檢測
取 S1～S9 DBM 標本以及滅活 DBM 標本（對照），分別采用 4 種方法提取 BMP-2 后，參照人 BMP-2 ELISA 試劑盒說明書檢測提取的 BMP-2 含量。每個樣品設置 6 個復孔。
① 蛋白酶抑制劑法：將 0.2 g DBM 樣品置于 1 mL 添加蛋白酶抑制劑的 Tris-HCl 溶液，于 4℃ 靜置 2 h，將混合物以離心半徑 8.5 cm、12 000 r/min離心 10 min，將上清液置于–80℃ 條件下儲存待檢測。
② 膠原酶法：將 0.2 g DBM 樣品置于 1.5 mL EP 管中，加入 1 mL 0.2 mol/L Tris-HCl 溶液，于 37℃ 溫育 2 h；加入 TESCA 緩沖液配置的Ⅰ型膠原酶溶液，于 37℃ 水浴中孵育過夜；以離心半徑 8.5 cm、12 000 r/min 離心 20 min。將上清液于 4℃ 條件下超濾透析純化蛋白，?80℃ 條件下儲存待檢測[11-12]。
③ 鹽酸胍/EDTA 法：將 30 mg DBM 樣品置于含 5 mmol/L 苯甲脒鹽酸鹽、1 mmol/L 苯甲基磺酰和 0.1 mmol/L 氨基己酸的鹽酸胍/EDTA 溶液（Tris 配置，pH7.4）。于 4℃ 水溶液中透析 72 h，每 24 小時更換 1 次透析液。取透析袋內混合物以離心半徑 8.5 cm、12 000 r/min 離心 10 min；取上清液保存于?80℃ 待檢測[13-14]。
④ RIPA 裂解液法：將 0.1 g DBM 樣品置于 1.5 mL EP 管中，加入 1 mL RIPA 裂解液以及 10 μL 蛋白酶抑制劑、10 μL 0.1 mmol/L EDTA 溶液，于 4℃ 條件下吹打混合物直至組織裂解。然后，以離心半徑 8.5 cm、12 000 r/min 離心 20 min；取上清液保存于?80℃ 待檢測。
1.4 體外成骨性能評價
1.4.1 DBM 與成骨細胞共培養
將 MC3T3-E1 細胞置于含 1% 青霉素/鏈霉素和 10%FBS 的 α-MEM 培養基中，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。每隔 1 d 換液，待細胞融合約 90% 時進行傳代，取第 3 代細胞進行實驗。采用 0.25% 胰蛋白酶溶液消化細胞，調整細胞濃度為 5.0×104個/mL。S1～S9 DBM 骨粉（S1～S9 組）以及滅活 DBM 骨粉（對照組）各取 1 mg，分別加入 24 孔培養板中，每孔加入 1.5 mL 細胞懸液，置于 37℃ 培養箱中培養。
1.4.2 觀測方法
① MTT 法檢測細胞增殖：共培養 1、4、7 d 后，每組各取 3 孔，分別加入 600 μL 5 mg/mL MTT，于 37℃ 放置 4 h；棄去 MTT 并加入 400 μL DMSO 振蕩 10 min；酶標儀測量 492 nm 處吸光度（A）值。
② 熒光染色觀察：共培養 7 d 后每組取 3 孔，PBS 溶液洗滌 2 次去除未貼壁細胞；將貼壁細胞置于 4% 多聚甲醛固定 40 min，PBS 溶液沖洗 3 次；DAPI 對細胞核進行染色。倒置熒光顯微鏡下觀察染色的細胞核。
③ ALP 活性檢測：共培養 7、14 d，每組各取 3 孔，?20℃ 下加入 0.2%Triton X-100 裂解細胞 10 min，置于 4℃ 冰箱裂解 1 h；吹打細胞懸液，于 4℃ 以離心半徑 8.5 cm、10 000 r/min 離心 10 min；取上清液與 100 μL 1 mg/mL pNPP 反應溶液混合，于 37℃ 反應 30 min。通過測量 405 nm 波長處A值確定 MC3T3-E1 細胞 ALP 活性，使用 BCA 蛋白質測定試劑盒在 562 nm 波長處測定總蛋白質含量。用總蛋白質濃度將 ALP 的相對活性進行標準化。
1.5 體內異位成骨誘導實驗
1.5.1 實驗分組及方法
將 30 只 BALB/c 雄性裸小鼠分為 10 組，分別為 S1～S9 DBM 組（S1～S9 組）以及滅活 DBM 組（對照組），每組 3 只。各組裸小鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉（0.2 mL/只）麻醉后，分別于雙側后肢大腿中部制備肌袋，根據分組每個肌袋植入對應 0.1 mL DBM 樣品。
1.5.2 組織學觀察
術后 4 周處死全部裸小鼠，取植入材料及其周圍組織，固定、脫鈣、包埋、切片（片厚 5 μm），常規 HE 染色后進行組織學觀察，評價新骨形成情況。新骨形成參照 “YY/T 1680-2020 同種異體修復材料脫礦骨材料的體內成骨誘導性能評價”[15]中的組織學結果評定標準進行半定量評價。由 2 個研究人員獨立盲評并統計。
1.6 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMP-2 含量檢測
4 種方法從 DBM 中提取的 BMP-2 檢測結果見圖 1。其中，鹽酸胍/EDTA 法 BMP-2 提取效率最高，蛋白酶抑制劑法最低。而且，不同供體制備的 DBM 中 BMP-2 含量差異較大，其中材料 S4 的 BMP-2 含量最高（平均 64.67 ng/g），其次為 S6（平均 52.35 ng/g）、S1（平均 37.23 ng/g）、S3（平均27.84 ng/g）、S2（平均 27.63 ng/g）、S5（平均 20.63 ng/g）、S8（平均 16.26 ng/g）、S7（平均 9.26 ng/g）、S9（平均 6.33 ng/g）。滅活 DBM 的 BMP-2 含量（平均 1.34 ng/g）明顯低于上述未滅活 DBM。其中滅活 DBM 以及 S7、S8、S9 材料的 BMP-2 含量均低于 20 ng/g。
圖1
S1～S9 以及滅活 DBM 經 4 種方法提取的 BMP-2 含量 比較
Figure1.
Comparison of BMP-2 contents extracted by 4 methods for S1-S9 and inactivated DBMs
2.2 體外成骨性能評價
2.2.1 MTT 法檢測細胞增殖
共培養后各組細胞A值均逐漸增加。其中，共培養 1 d，與對照組比較，S1、S2、S3、S4、S6 組A值明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）；與 S4 組相比，S5、S7、S8、S9 組A值明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。4 d 時，與對照組比較，S4、S6 組明顯增高（P<0.05）；并且 S4 組明顯高于其他 DBM 組（P<0.05）。7 d 時，與對照組比較，S1～S6 組A值均明顯增高（P<0.05），且 S4 組明顯高于其他 DBM 組（P<0.05）。見圖 2。
圖2
MTT 法檢測 MC3T3-E1 細胞與不同 DBM 共培養 1、4、 7 d 增殖情況
Figure2.
The proliferations of MC3T3-E1 cells co-cultured with different DBMs for 1, 4, and 7 days by MTT method
2.2.2 熒光染色觀察
倒置熒光顯微鏡下觀察，共培養 7 d 后各組成骨細胞均狀態良好，可見絲狀偽足，其中 S1、S2、S3、S4、S6 組成骨細胞多于其他組，且 S4 組成骨細胞最多。見圖 3。
圖3
各組熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
a. 對照組；b～j. S1～S9 組
Figure3. Fluorescence staining observation of each group (Inverted fluorescence microscope×100)a. Control group; b-j. S1-S9 groups
2.2.3 ALP 活性檢測
共培養 7 d 時，與對照組比較，S1、S2、S3、S4、S6 組 ALP 活性明顯增高（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。14 d 時，與對照組比較，S4、S6 組 ALP 進一步增加（P<0.05），且 S4、S6 組間差異無統計學意義（P>0.05）；與 S4 組比較，S7、S8、S9 組 ALP 明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
共培養 7 d 及 14 d 各組 ALP 活性檢測
Figure4.
ALP activity in each group for 7 and 14 days of co-cultivation
2.3 體內異位成骨誘導實驗
術后 4 周，HE 染色觀察見對照組植骨區域新生骨較少。各 DBM 組中，BMP-2 含量較高的 S1～S6 組植骨區域均可見軟骨和新骨生成，并且隨著 BMP-2 含量增加，材料的成骨活性越好，材料邊緣的腔隙內可觀察到越多的新骨生成；S4、S6 組骨新生區域含有大量軟骨細胞和成骨細胞。見圖 5。
圖5
術后 4 周各組 HE 染色觀察（左：×100，右：×200）
a. 對照組；b～j. S1～S9 組
Figure5. HE staining in each group at 4 weeks after operation (Left: ×100, right: ×200)a. Control group; b-j. S1-S9 groups
半定量分析顯示，對照組新骨形成評分為 1 分。與對照組比較，S1～S6 組新骨形成評分明顯增高（P<0.05），S7、S8、S9 組評分無明顯差異（P>0.05），表明 S7、S8、S9 組無成骨活性。見圖 6。
圖6
術后 4 周各組組織學觀察半定量評分
Figure6.
Semi-quantitative score of histological observation in each group at 4 weeks after operation
3 討論
研究者普遍認為 DBM 中的 BMP-2 是誘導體內異位成骨的主要因素，因此可通過直接檢測 BMP-2 含量間接評估 DBM 產品體內成骨活性，是一種快速、便捷的方法。目前，BMP-2 提取方法主要有膠原酶法、蛋白酶抑制劑法、鹽酸胍/EDTA 法和 RIPA 裂解液法。本研究顯示上述 4 種方法的 BMP-2 提取效率差異較大，其中鹽酸胍/EDTA 法效率最高，分析與 BMP 蛋白是一種酸性多肽，不溶于水，可溶于中性鹽溶液，尤其是鹽酸胍溶液中有關。為此，Cook[16]的研究選擇將 BMP 溶于鹽酸胍溶液后，直接注入新鮮骨折模型中。但是上述 BMP-2 提取方法存在需脫鈣、浸提處理以及長時間暴露于體外等問題，造成 BMP-2 蛋白失活，因此不能準確反映 DBM 中的真實 BMP-2 含量，故通過單純 BMP-2 定量檢測評價 DBM 成骨活性具有一定局限性。
相比體內異位成骨實驗，體外細胞實驗是一種經濟的評價 DBM 活性方法。BMP-2 是一種包含 396 個氨基酸的多肽生長因子，可誘導未分化的 MSCs 形成軟骨和骨組織，促進成骨細胞增殖[17-18]，是促進成骨分化能力最強的細胞因子[19-20]，以此促使成骨細胞 ALP 表達升高。而且細胞對 BMP-2 的刺激具有較高敏感性，可以精確反映不同骨組織中 BMP-2 含量的微小差異。但是，目前尚無證據表明 BMP-2 含量與細胞增殖分化和 ALP 活性具有劑量關系。本研究發現隨著 DBM 中 BMP-2 含量升高，共培養的成骨細胞增殖能力也越強。當成骨細胞與 DBM 材料共培養 7 d，BMP-2 含量低于 20 ng/mg 的 DBM 樣品 S7、S8、S9 中共培養的細胞增殖能力較差，與滅活 DBM 相比無顯著差異。該結果與 14 d 時 ALP 表達檢測結果相對應。
體內異位成骨實驗能夠直接且全面地評價材料成骨活性。本研究結果提示，隨著 DBM 中 BMP-2 含量升高，其體內成骨活性也越強。其中 BMP-2 含量最高的DBM S4 表面有大量成骨細胞吸附，成骨最活躍，表現出最佳成骨活性，新骨形成評分也最高。相對而言，BMP-2 含量較低的 S7、S8 及 S9 成骨活性較差，與滅活 DBM 相比無顯著性差異，新骨形成評分也較低。體內的異位成骨實驗結果與體外細胞實驗以及 BMP-2 定量結果相對應，體現出三者的相關性。
綜上述，BMP-2 含量會顯著影響 DBM 成骨活性。當 BMP-2 含量>20.63 ng/g 時，DBM 成骨活性較好；<16.26 ng/g 時，DBM 在體內及體外均不具備骨誘導能力。這為組織庫或同種異體骨生產企業評價 DBM 產品提供了新的思路。然而本研究樣本量較少，對于通過 BMP-2 定量檢測和體外成骨細胞增殖分化實驗評估 DBM 成骨活性的準確度，有待進一步探究。
作者貢獻：李淼直接參與DBM制備、BMP-2提取及檢測、體外細胞實驗以及數據收集和文章撰寫；潘小亮參與DBM制備；汪晶晶、陳維明、駱井萬、胡凱參與動物實驗；白玉龍、陳金發提供實驗設計思路并把控實驗實施、文章修改并，對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經北京大學生物醫學倫理委員會實驗動物福利倫理分會委員批準（LA2019019）。
