引用本文： 蔡江瑜, 蔣佳, 莫秀梅, 陳世益. 絲素蛋白/聚乳酸-聚己內酯納米纖維支架對兔腱-骨愈合影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(8): 957-962. doi: 10.7507/1002-1892.201704077 復制
膝關節前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷是臨床常見運動損傷。ACL 損傷后會造成膝關節不穩定，早期出現關節活動減少、功能減退，如長期關節不穩則可能發生骨關節炎[1-2]。自體肌腱是重建 ACL 常用的移植物，但仍存在腱-骨愈合時間較長以及愈合欠佳等問題。為此，如何促進腱-骨愈合并提高愈合質量已成為運動醫學領域的研究熱點。目前，研究主要關注于腱-骨界面的整合，包括采用骨膜、生物材料、生長因子、細胞基質，以及富血小板血漿等方法促進腱-骨愈合。除骨膜已用于臨床手術外，其余方法的效果尚無明確結論。但是，骨膜存在取材有限、損傷供區、骨膜兩面活性和結構存在差異等問題，限制了其進一步應用[3]。靜電紡絲納米纖維支架是一種新型生物材料，所需設備相對簡單、操作性強，且制備時材料化學組分和物理性能易控制，可最大程度仿生細胞外基質結構，為組織再生提供良好的微環境[4]。本研究利用靜電紡絲技術制備絲素蛋白（silk fibroin，SF）/聚乳酸-聚己內酯[poly（L-lactic acid-co-e-capro-lactone），P（LLA-CL）]納米纖維支架，探討其在腱-骨愈合方面的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
16 周齡新西蘭大白兔 24 只，雌性 10 只，雄性 14 只，體質量（2.9±0.4）kg，由上海交通大學農學院提供。去蛹家蠶繭由浙江嘉欣絲綢股份有限公司提供。P（LLA-CL）由日本奈良醫科大學提供。小鼠胚胎成骨細胞前體細胞 MC3T3-E1 由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫提供。靜電發生器（北京機電高等技術股份有限公司）；注射泵（Cole-pamer 公司，美國）；掃描電鏡（JEOL 公司，日本）；Image J 圖像分析軟件（美國國立衛生研究院）；電子萬能材料測試機（Shimadzu 公司，日本）。
1.2 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架的制備及觀察
1.2.1 紡絲溶液配制 將去蛹家蠶繭放入 100℃ 的 0.5%（W/V）Na2CO3 水溶液中煮 3 次，每次 30 min，蒸餾水充分洗凈，放入烘箱內干燥后用三元溶劑[CaCl2∶C2H5OH∶H2O=1∶2∶8（摩爾比）] 70℃ 溶解 1 h，冷卻后裝入透析袋，用蒸餾水透析 3 d，過濾，冷凍干燥得到 SF。取等質量 SF 和 P（LLA-CL），共混后溶解于六氟異丙醇，配制成總濃度為 8% 的溶液，室溫下攪拌過夜。
1.2.2 靜電紡絲技術制備納米纖維支架 將紡絲溶液注入 10 mL 注射器中，連接靜電紡絲裝置，調整溶液流速為 1.2 mL/h，電壓 12 kV，接收距離 15～20 cm，將包有鋁箔的方形板作為接地的接收器，接收納米纖維支架。
1.2.3 納米纖維支架形貌表征觀察 收集鋁箔上的納米纖維支架，噴金，然后在 10 kV 加速電壓下，掃描電鏡觀察樣本形態。使用 Image J 圖像分析軟件測量 50 根纖維直徑。
1.2.4 納米纖維支架細胞相容性觀察 將直徑為 15 mm 的圓形 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架放入 24 孔板內，每孔 1 塊，75% 乙醇浸泡消毒 1 h。然后吸出乙醇，PBS 緩沖液沖洗 3 遍，將 MC3T3-E1 細胞按照 2×104 個/cm2密度種植于支架，加入含 10%FBS 及 1% 雙抗的α-MEM 培養液。細胞培養 1、3、5 d 后，各取 4 孔，PBS 緩沖液洗 3 遍，加入 2.5% 戊二醛溶液固定 30 min。PBS 緩沖液沖洗 3 遍，去除殘余的戊二醛，不同濃度乙醇（50%、70%、80%、90%、100%）梯度脫水，每種濃度脫水 2 次，每次 5 min，室溫下干燥、噴金，于 10 kV 加速電壓下掃描電鏡觀測細胞黏附和增殖情況。
1.3 動物實驗觀察
1.3.1 動物模型制備及分組 取 24 只新西蘭大白兔隨機分為自體肌腱組（對照組）和 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架包裹自體肌腱組（實驗組），每組 12 只。兩組動物以耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，仰臥位固定于操作臺。取對側自體跟腱組織，并建立關節外模型。具體步驟：于左后肢踝關節后方作正中縱行切口，長約 3 cm，切取長約 2 cm 的跟腱組織。取右后肢髕旁外內側入路，于脛骨近端用直徑 3.5 mm 的克氏針鉆取骨隧道，對照組將自體跟腱拉入骨隧道內，實驗組將 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架卷曲包裹自體跟腱，用 3-0 縫線固定頭端后拉入骨隧道內，內側隧道口外保留 5 mm 長移植物，逐層間斷縫合切口。見圖 1。
圖1
實驗組動物模型制備步驟
a. 暴露左后肢跟腱組織；b. 切取長 2 cm 跟腱移植物，并包裹納米纖維支架；c. 用直徑 3.5 mm 的克氏針鉆取脛骨隧道；d. 移植物完全進入骨隧道內，隧道口外保留 5 mm 長度
Figure1. Animal surgery procedure in experimental groupa. Exposure of Achilles tendon of left hind limb; b. Achilles tendon graft with a length of 2 cm was harvested and wrapped with scaffold; c. The bone tunnel of the tibia made by Kirschner wire with a diameter of 3.5 mm;d. Achilles tendon graft was completely passed through the bone tunnel while the end was left outside
術后單籠飼養動物，允許自由活動；每天肌肉注射青霉素 40 萬 U，連續 3 d。術后 6 周及 12 周兩組各取 6 只動物空氣栓塞法處死，按照原切口入路，截取脛骨移植物復合體行組織學評價（n=3）及生物力學檢測（n=3）。
1.3.2 觀測指標 ① 組織學評價：將脛骨移植物復合體置于 10% 甲醛中固定 48 h 后，于甲酸脫鈣液中脫鈣 4 周，經脫水、透明、石蠟包埋，制成 7 μm 厚切片。常規 HE 染色，鏡下觀察腱-骨界面及組織生長情況，評價腱-骨愈合效果。
② 生物力學檢測：取脛骨移植物復合體，用 Ethibond W4843 縫線固定內側隧道口外的移植物用于測試時拉伸，將標本及縫線固定于電子萬能材料測試機（圖 2）。首先以 1 N 拉力預張 5 min，然后以 2 mm/min 速度拉伸，當移植物從隧道拉出或拉斷時，生物力學測試終止。記錄拉伸-形變曲線，計算脛骨移植物復合體失效負荷及剛度。
圖2
生物力學測試
Figure2.
Mechanical testing
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 納米纖維支架形貌表征觀察及細胞相容性評估
掃描電鏡下觀察見，納米纖維支架為非取向結構，纖維直徑為（219.4±66.5）nm，直徑分布范圍 115.9～352.5 mm。見圖 3。MC3T3-E1 細胞與納米纖維支架復合培養后，掃描電鏡觀察示細胞形態正常，生長良好，并隨培養時間延長細胞逐漸增多，提示支架具有較好的細胞相容性。見圖 4。
圖3
掃描電鏡觀察 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架 （×3 000）
Figure3.
SEM observation of SF/P(LLA-CL) nanofibrous scaffold (×3 000)
圖4
MC3T3-E1 細胞與 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架復合培養后各時間點掃描電鏡觀察（×500）
a. 培養 1 d；b. 培養 3 d；c. 培養 5 d
Figure4. SEM observation of MC3T3-E1 cells cultured on the SF/P(LLA-CL) nanofibrous scaffold at each time point (×500)a. At 1 day; b. At 3 days; c. At 5 days
2.2 動物實驗觀察
2.2.1 組織學觀察 術后 6 周，兩組腱-骨界面均有炎性細胞浸潤，界面寬度未見明顯差異。術后 12 周，實驗組腱-骨界面可見新骨長入，與肌腱組織融合，未見明顯纖維組織瘢痕帶；而對照組腱-骨界面之間可見纖維組織瘢痕帶，無新骨長入。各時間點每組 3 個樣本組織學結果基本一致。見圖 5。
圖5
兩組術后 6 周及 12 周組織學觀察（HE×200）
G：跟腱移植物；IF：腱-骨界面；HB：宿主骨 a. 實驗組術后 6 周；b. 對照組術后 6 周；c. 實驗組術后 12 周；d. 對照組術后 12 周
Figure5. Histological observation of 2 groups at 6 and 12 weeks after operation (HE×200)G: Achilles tendon graft; IF: Tendon-bone interface; HB: Host bone a. Experimental group at 6 weeks after operation; b. Control group at 6 weeks after operation; c. Experimental group at 12 weeks after operation; d. Control group at 12 weeks after operation
2.2.2 生物力學測試 兩組移植物均從骨隧道內完整拉出，未發生斷裂。術后 6 周，實驗組失效負荷為（24.9±2.5）N，高于對照組的（22.0±2.8）N，但組間比較差異無統計學意義（t=1.364，P=0.244）；術后 12 周，實驗組的失效負荷為（62.6±6.4）N，明顯高于對照組的（44.7±3.7）N，組間比較差異有統計學意義（t=4.194，P=0.014）。術后 6 周，實驗組及對照組剛度分別為（4.4±0.5）、（4.1±0.4）N/mm，兩組比較差異無統計學意義（t=0.854，P=0.441）；術后 12 周，實驗組剛度為（13.0±0.5）N/mm，明顯高于對照組的（7.9±0.6）N/mm，組間比較差異有統計學意義（t=11.585，P=0.000）。
3 討論
研究表明，自體肌腱重建 ACL 術后其韌帶化過程均要經歷早期、重塑期和成熟期[5]。生物支架的作用是通過在腱-骨之間建立一個適合細胞增殖和分化的環境來促進細胞黏附和增殖，并隨著時間的延長生物支架逐步降解，從而縮短腱-骨愈合時間，提高愈合質量[6]。
SF/P（LLA-CL）材料已廣泛用于組織工程研究。SF/P（LLA-CL）材料是由具有良好生物相容性的 SF 以及具有較強力學性能的 P（LLA-CL）共混獲得，因此兼有二者優點[7-9]。Wang 等[10]通過體內外實驗證實質量比為 50∶50 的 SF/P（LLA-CL）支架成骨作用最強，一方面可促進人脂肪干細胞的成骨分化，促進成骨相關基因骨唾液酸蛋白、Ⅰ型膠原蛋白和骨橋蛋白等的表達，另一方面可修復大鼠直徑 8 mm 的顱骨骨缺損。表明 SF/P（LLA-CL）材料具有良好的生物相容性和潛在的成骨誘導能力。但目前罕見該材料在腱-骨愈合方面的相關研究。因此，我們利用靜電紡絲技術制備了 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架，探討其能否促進腱-骨愈合。依據 Wang 等[10]的研究，本研究也以質量比 50∶50 制備 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架，MC3T3-E1 細胞在支架上生長良好，提示支架具有較好的細胞相容性。生物力學測試結果顯示，術后 12 周實驗組失效負荷和剛度顯著高于對照組，差異有統計學意義，分析可能與支架誘導組織長入，進一步增強腱-骨界面的整合有關。
本研究組織學結果顯示，術后 12 周實驗組可見新骨長入，提示 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架具有成骨特性，該特性可能是由 SF 決定的。骨Ⅰ型膠原基本結構單位是原膠原，在膠原纖維內部，原膠原之間的間隙是生物礦化發生之處[11]。而 SF 與Ⅰ型膠原結構類似，可以通過調節羥基磷灰石納米晶體的形成，促進細胞外基質的礦化作用[12-14]。此外，SF 能夠通過抑制 Notch 通路而發揮成骨誘導作用[15]。Jung 等[16]的研究證實，低分子絲蛋白肽可以顯著下調 BMSCs 中的 Notch 通路，從而增強 ALP 和 Runx2 mRNA 的表達。
此外，材料的形貌特征對細胞黏附和增殖也起著關鍵作用[17-19]。Yin 等[20]在取向及非取向聚左旋乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）納米支架上培養人肌腱干/祖細胞（human tendon stem/progenitor cells，hTSPCs），結果發現取向支架可誘導 hTSPCs 向肌腱方向分化，而非取向支架可誘導 hTSPCs 向成骨方向分化。此后，Yin 等[21]進一步進行了動物實驗證實該結論，將兩種支架用于修復大鼠跟腱缺損，結果發現取向支架組跟腱有序生長，而非取向支架組出現異位骨化。類似地，Zhang 等[22]將殼聚糖、PLLA、明膠、聚環氧乙烷按質量比 62.1∶20.7∶10.3∶6.9 配制成溶液，分別制備取向和非取向支架，然后在支架上培養誘導多能干細胞-MSCs 復合細胞，發現非取向支架能促進細胞向成骨方向分化，并通過動物實驗進一步證實其成骨特性。本研究制備的是非取向納米纖維支架，非取向的形貌結構在一定程度上起到了成骨作用。
綜上述，非取向的 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架具有良好生物相容性，體內實驗證實其能有效促進腱-骨愈合，為臨床上 ACL 重建移植物的改良提供新思路。但本研究也存在一些不足：研究樣本量少、關節外模型無法完全模擬 ACL 重建后的狀態。下一步我們將利用 ACL 重建模型研究該納米纖維支架用于關節內重建的效果。
膝關節前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷是臨床常見運動損傷。ACL 損傷后會造成膝關節不穩定，早期出現關節活動減少、功能減退，如長期關節不穩則可能發生骨關節炎[1-2]。自體肌腱是重建 ACL 常用的移植物，但仍存在腱-骨愈合時間較長以及愈合欠佳等問題。為此，如何促進腱-骨愈合并提高愈合質量已成為運動醫學領域的研究熱點。目前，研究主要關注于腱-骨界面的整合，包括采用骨膜、生物材料、生長因子、細胞基質，以及富血小板血漿等方法促進腱-骨愈合。除骨膜已用于臨床手術外，其余方法的效果尚無明確結論。但是，骨膜存在取材有限、損傷供區、骨膜兩面活性和結構存在差異等問題，限制了其進一步應用[3]。靜電紡絲納米纖維支架是一種新型生物材料，所需設備相對簡單、操作性強，且制備時材料化學組分和物理性能易控制，可最大程度仿生細胞外基質結構，為組織再生提供良好的微環境[4]。本研究利用靜電紡絲技術制備絲素蛋白（silk fibroin，SF）/聚乳酸-聚己內酯[poly（L-lactic acid-co-e-capro-lactone），P（LLA-CL）]納米纖維支架，探討其在腱-骨愈合方面的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
16 周齡新西蘭大白兔 24 只，雌性 10 只，雄性 14 只，體質量（2.9±0.4）kg，由上海交通大學農學院提供。去蛹家蠶繭由浙江嘉欣絲綢股份有限公司提供。P（LLA-CL）由日本奈良醫科大學提供。小鼠胚胎成骨細胞前體細胞 MC3T3-E1 由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫提供。靜電發生器（北京機電高等技術股份有限公司）；注射泵（Cole-pamer 公司，美國）；掃描電鏡（JEOL 公司，日本）；Image J 圖像分析軟件（美國國立衛生研究院）；電子萬能材料測試機（Shimadzu 公司，日本）。
1.2 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架的制備及觀察
1.2.1 紡絲溶液配制 將去蛹家蠶繭放入 100℃ 的 0.5%（W/V）Na2CO3 水溶液中煮 3 次，每次 30 min，蒸餾水充分洗凈，放入烘箱內干燥后用三元溶劑[CaCl2∶C2H5OH∶H2O=1∶2∶8（摩爾比）] 70℃ 溶解 1 h，冷卻后裝入透析袋，用蒸餾水透析 3 d，過濾，冷凍干燥得到 SF。取等質量 SF 和 P（LLA-CL），共混后溶解于六氟異丙醇，配制成總濃度為 8% 的溶液，室溫下攪拌過夜。
1.2.2 靜電紡絲技術制備納米纖維支架 將紡絲溶液注入 10 mL 注射器中，連接靜電紡絲裝置，調整溶液流速為 1.2 mL/h，電壓 12 kV，接收距離 15～20 cm，將包有鋁箔的方形板作為接地的接收器，接收納米纖維支架。
1.2.3 納米纖維支架形貌表征觀察 收集鋁箔上的納米纖維支架，噴金，然后在 10 kV 加速電壓下，掃描電鏡觀察樣本形態。使用 Image J 圖像分析軟件測量 50 根纖維直徑。
1.2.4 納米纖維支架細胞相容性觀察 將直徑為 15 mm 的圓形 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架放入 24 孔板內，每孔 1 塊，75% 乙醇浸泡消毒 1 h。然后吸出乙醇，PBS 緩沖液沖洗 3 遍，將 MC3T3-E1 細胞按照 2×104 個/cm2密度種植于支架，加入含 10%FBS 及 1% 雙抗的α-MEM 培養液。細胞培養 1、3、5 d 后，各取 4 孔，PBS 緩沖液洗 3 遍，加入 2.5% 戊二醛溶液固定 30 min。PBS 緩沖液沖洗 3 遍，去除殘余的戊二醛，不同濃度乙醇（50%、70%、80%、90%、100%）梯度脫水，每種濃度脫水 2 次，每次 5 min，室溫下干燥、噴金，于 10 kV 加速電壓下掃描電鏡觀測細胞黏附和增殖情況。
1.3 動物實驗觀察
1.3.1 動物模型制備及分組 取 24 只新西蘭大白兔隨機分為自體肌腱組（對照組）和 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架包裹自體肌腱組（實驗組），每組 12 只。兩組動物以耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，仰臥位固定于操作臺。取對側自體跟腱組織，并建立關節外模型。具體步驟：于左后肢踝關節后方作正中縱行切口，長約 3 cm，切取長約 2 cm 的跟腱組織。取右后肢髕旁外內側入路，于脛骨近端用直徑 3.5 mm 的克氏針鉆取骨隧道，對照組將自體跟腱拉入骨隧道內，實驗組將 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架卷曲包裹自體跟腱，用 3-0 縫線固定頭端后拉入骨隧道內，內側隧道口外保留 5 mm 長移植物，逐層間斷縫合切口。見圖 1。
圖1
實驗組動物模型制備步驟
a. 暴露左后肢跟腱組織；b. 切取長 2 cm 跟腱移植物，并包裹納米纖維支架；c. 用直徑 3.5 mm 的克氏針鉆取脛骨隧道；d. 移植物完全進入骨隧道內，隧道口外保留 5 mm 長度
Figure1. Animal surgery procedure in experimental groupa. Exposure of Achilles tendon of left hind limb; b. Achilles tendon graft with a length of 2 cm was harvested and wrapped with scaffold; c. The bone tunnel of the tibia made by Kirschner wire with a diameter of 3.5 mm;d. Achilles tendon graft was completely passed through the bone tunnel while the end was left outside
術后單籠飼養動物，允許自由活動；每天肌肉注射青霉素 40 萬 U，連續 3 d。術后 6 周及 12 周兩組各取 6 只動物空氣栓塞法處死，按照原切口入路，截取脛骨移植物復合體行組織學評價（n=3）及生物力學檢測（n=3）。
1.3.2 觀測指標 ① 組織學評價：將脛骨移植物復合體置于 10% 甲醛中固定 48 h 后，于甲酸脫鈣液中脫鈣 4 周，經脫水、透明、石蠟包埋，制成 7 μm 厚切片。常規 HE 染色，鏡下觀察腱-骨界面及組織生長情況，評價腱-骨愈合效果。
② 生物力學檢測：取脛骨移植物復合體，用 Ethibond W4843 縫線固定內側隧道口外的移植物用于測試時拉伸，將標本及縫線固定于電子萬能材料測試機（圖 2）。首先以 1 N 拉力預張 5 min，然后以 2 mm/min 速度拉伸，當移植物從隧道拉出或拉斷時，生物力學測試終止。記錄拉伸-形變曲線，計算脛骨移植物復合體失效負荷及剛度。
圖2
生物力學測試
Figure2.
Mechanical testing
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 納米纖維支架形貌表征觀察及細胞相容性評估
掃描電鏡下觀察見，納米纖維支架為非取向結構，纖維直徑為（219.4±66.5）nm，直徑分布范圍 115.9～352.5 mm。見圖 3。MC3T3-E1 細胞與納米纖維支架復合培養后，掃描電鏡觀察示細胞形態正常，生長良好，并隨培養時間延長細胞逐漸增多，提示支架具有較好的細胞相容性。見圖 4。
圖3
掃描電鏡觀察 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架 （×3 000）
Figure3.
SEM observation of SF/P(LLA-CL) nanofibrous scaffold (×3 000)
圖4
MC3T3-E1 細胞與 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架復合培養后各時間點掃描電鏡觀察（×500）
a. 培養 1 d；b. 培養 3 d；c. 培養 5 d
Figure4. SEM observation of MC3T3-E1 cells cultured on the SF/P(LLA-CL) nanofibrous scaffold at each time point (×500)a. At 1 day; b. At 3 days; c. At 5 days
2.2 動物實驗觀察
2.2.1 組織學觀察 術后 6 周，兩組腱-骨界面均有炎性細胞浸潤，界面寬度未見明顯差異。術后 12 周，實驗組腱-骨界面可見新骨長入，與肌腱組織融合，未見明顯纖維組織瘢痕帶；而對照組腱-骨界面之間可見纖維組織瘢痕帶，無新骨長入。各時間點每組 3 個樣本組織學結果基本一致。見圖 5。
圖5
兩組術后 6 周及 12 周組織學觀察（HE×200）
G：跟腱移植物；IF：腱-骨界面；HB：宿主骨 a. 實驗組術后 6 周；b. 對照組術后 6 周；c. 實驗組術后 12 周；d. 對照組術后 12 周
Figure5. Histological observation of 2 groups at 6 and 12 weeks after operation (HE×200)G: Achilles tendon graft; IF: Tendon-bone interface; HB: Host bone a. Experimental group at 6 weeks after operation; b. Control group at 6 weeks after operation; c. Experimental group at 12 weeks after operation; d. Control group at 12 weeks after operation
2.2.2 生物力學測試 兩組移植物均從骨隧道內完整拉出，未發生斷裂。術后 6 周，實驗組失效負荷為（24.9±2.5）N，高于對照組的（22.0±2.8）N，但組間比較差異無統計學意義（t=1.364，P=0.244）；術后 12 周，實驗組的失效負荷為（62.6±6.4）N，明顯高于對照組的（44.7±3.7）N，組間比較差異有統計學意義（t=4.194，P=0.014）。術后 6 周，實驗組及對照組剛度分別為（4.4±0.5）、（4.1±0.4）N/mm，兩組比較差異無統計學意義（t=0.854，P=0.441）；術后 12 周，實驗組剛度為（13.0±0.5）N/mm，明顯高于對照組的（7.9±0.6）N/mm，組間比較差異有統計學意義（t=11.585，P=0.000）。
3 討論
研究表明，自體肌腱重建 ACL 術后其韌帶化過程均要經歷早期、重塑期和成熟期[5]。生物支架的作用是通過在腱-骨之間建立一個適合細胞增殖和分化的環境來促進細胞黏附和增殖，并隨著時間的延長生物支架逐步降解，從而縮短腱-骨愈合時間，提高愈合質量[6]。
SF/P（LLA-CL）材料已廣泛用于組織工程研究。SF/P（LLA-CL）材料是由具有良好生物相容性的 SF 以及具有較強力學性能的 P（LLA-CL）共混獲得，因此兼有二者優點[7-9]。Wang 等[10]通過體內外實驗證實質量比為 50∶50 的 SF/P（LLA-CL）支架成骨作用最強，一方面可促進人脂肪干細胞的成骨分化，促進成骨相關基因骨唾液酸蛋白、Ⅰ型膠原蛋白和骨橋蛋白等的表達，另一方面可修復大鼠直徑 8 mm 的顱骨骨缺損。表明 SF/P（LLA-CL）材料具有良好的生物相容性和潛在的成骨誘導能力。但目前罕見該材料在腱-骨愈合方面的相關研究。因此，我們利用靜電紡絲技術制備了 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架，探討其能否促進腱-骨愈合。依據 Wang 等[10]的研究，本研究也以質量比 50∶50 制備 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架，MC3T3-E1 細胞在支架上生長良好，提示支架具有較好的細胞相容性。生物力學測試結果顯示，術后 12 周實驗組失效負荷和剛度顯著高于對照組，差異有統計學意義，分析可能與支架誘導組織長入，進一步增強腱-骨界面的整合有關。
本研究組織學結果顯示，術后 12 周實驗組可見新骨長入，提示 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架具有成骨特性，該特性可能是由 SF 決定的。骨Ⅰ型膠原基本結構單位是原膠原，在膠原纖維內部，原膠原之間的間隙是生物礦化發生之處[11]。而 SF 與Ⅰ型膠原結構類似，可以通過調節羥基磷灰石納米晶體的形成，促進細胞外基質的礦化作用[12-14]。此外，SF 能夠通過抑制 Notch 通路而發揮成骨誘導作用[15]。Jung 等[16]的研究證實，低分子絲蛋白肽可以顯著下調 BMSCs 中的 Notch 通路，從而增強 ALP 和 Runx2 mRNA 的表達。
此外，材料的形貌特征對細胞黏附和增殖也起著關鍵作用[17-19]。Yin 等[20]在取向及非取向聚左旋乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）納米支架上培養人肌腱干/祖細胞（human tendon stem/progenitor cells，hTSPCs），結果發現取向支架可誘導 hTSPCs 向肌腱方向分化，而非取向支架可誘導 hTSPCs 向成骨方向分化。此后，Yin 等[21]進一步進行了動物實驗證實該結論，將兩種支架用于修復大鼠跟腱缺損，結果發現取向支架組跟腱有序生長，而非取向支架組出現異位骨化。類似地，Zhang 等[22]將殼聚糖、PLLA、明膠、聚環氧乙烷按質量比 62.1∶20.7∶10.3∶6.9 配制成溶液，分別制備取向和非取向支架，然后在支架上培養誘導多能干細胞-MSCs 復合細胞，發現非取向支架能促進細胞向成骨方向分化，并通過動物實驗進一步證實其成骨特性。本研究制備的是非取向納米纖維支架，非取向的形貌結構在一定程度上起到了成骨作用。
綜上述，非取向的 SF/P（LLA-CL）納米纖維支架具有良好生物相容性，體內實驗證實其能有效促進腱-骨愈合，為臨床上 ACL 重建移植物的改良提供新思路。但本研究也存在一些不足：研究樣本量少、關節外模型無法完全模擬 ACL 重建后的狀態。下一步我們將利用 ACL 重建模型研究該納米纖維支架用于關節內重建的效果。
