引用本文： 汪洋, 顏華. 煙酸對糖尿病大鼠血視網膜屏障的影響及其機制研究. 中華眼底病雜志, 2016, 32(2): 154-158. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.02.010 復制
血視網膜屏障(BRB)損傷導致的視網膜血管通透性增加是非增生型糖尿病視網膜病變(DR)的病理特征以及視力喪失的主要原因[1]。DR發生發展過程中，各種炎癥因子相互作用可影響BRB的完整性[2]。作為一種調脂藥物，煙酸可降低總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)，升高高密度脂蛋白(HDL)；并且通過煙酸受體G蛋白偶聯受體109A(GPR109A)在脂肪組織中抑制甘油三脂水解，從而具有改善血管內皮功能，降低血管通透性的作用[3]。研究發現，GPR109A存在于視網膜上并且在DR發生發展過程中發揮重要作用[4]。但煙酸能否通過視網膜中的GPR109A而影響DR的BRB卻少有報道。為此，我們觀察探討了煙酸對糖尿病大鼠BRB的影響及其機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
6～8 周齡、體重210～250 g的無特定病原級雄性Wistar大鼠(北京維通利華實驗動物有限公司提供)60只用于本研究。實驗動物喂養、使用以及相關操作嚴格遵循動物實驗倫理規范以及天津醫科大學實驗動物管理倫理委員會的相關規定。以標準顆粒飼養于標準化動物房，自由飲水攝食，室溫22~24℃，相對濕度40%~60%。適應性飼養1周后用于實驗。
隨機數字表法將大鼠分為空白對照組(CON組)、糖尿病模型對照組(DM組)和煙酸處理組(NA組)，每組20只。CON組大鼠僅注射檸檬酸鹽緩沖液。DM組、NA組大鼠建立糖尿病模型[5]。建模成功后第7天，NA組大鼠以40 mg/kg的劑量灌胃給予煙酸，1次/d，持續灌胃3個月。CON組、DM組大鼠正常喂食水。
于NA組大鼠灌胃3個月后，3組大鼠均于內眥處取血，采用自動生化分析儀檢測血清TC、HDL水平。
于NA組大鼠灌胃3個月后，各組取4只大鼠，10%水合氯醛麻醉處死，摘取眼球制備石蠟切片。連續4 μm切片，進行常規蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。
于NA組大鼠灌胃3個月后，各組取3只大鼠，以45 mg/kg的劑量尾靜脈注射2% 伊凡思藍(EB)溶液，循環2 h。處死大鼠，摘取眼球，置于濃度為4%多聚甲醛溶液中固定2 h。手術顯微鏡下除去角膜、虹膜，娩出晶狀體和玻璃體，完整分離出視網膜，平鋪于載玻片上，封片，立即置于激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下觀察、照相。各組取6只大鼠，EB染色滲漏分析法[6]檢測大鼠視網膜血管滲漏性，分別測定其在波長為620、740 nm的吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值。共測3次，取其平均值。
于NA組大鼠灌胃3個月后，各組取3只大鼠，檢測大鼠視網膜中閉合蛋白(Occludin)、封閉蛋白(Claudin)-5、緊密連接蛋白(ZO)-1、GPR109A的mRNA相對表達量。采用Trizol法提取視網膜總RNA，ND-1000微量紫外可見分光光度計檢測RNA濃度。根據引物設計原則，由上海生工設計并合成針對大鼠的β-肌動蛋白(actin)、Occludin、Claudin-5、ZO-1、 GPR109A的特異性引物。配置聚合酶鏈反應(PCR)體系，將反應板放入7700型熒光定量逆轉錄PCR(RT-PCR)儀進行擴增[7]。
采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測大鼠視 網膜中GPR109A、白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)蛋白相對表達量。取-80℃凍存視網膜組織，于細胞裂解液中研磨，取上清液行視網膜總蛋白定量后，行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入GPR109A(1:500)、IL-6(1:1000)、 TNF-α(1:1000)、β-actin(1:1000)抗體孵育過夜，辣根過氧化酶標記的二抗(1:5000)37℃ 孵育1 h。 應用 Bio-Rad 公司的Quantity One 4.4.0 分析軟件測定每一個目的條帶及其對應的內參β-actin灰度值。按照相對灰度值＝目的條帶灰度值/同一樣品β-actin 的灰度值計算每個樣品相應指標的灰度值，以此代表目的蛋白的表達水平。
采用SPSS 17.0統計學軟件進行統計分析，計量指標數據資料經Kolmogorov-Smirnov檢驗呈正態分布，以均數±標準差(
2 結果
3組大鼠血清TC、HDL含量比較，差異均有統計學意義(F=22.273、13.306，P＜0.05)。與CON組比較，DM組大鼠血清TC含量明顯升高，HDL含量明顯降低，差異均有統計學意義(t=4.034、5.831，P＜0.05)。與DM組比較，NA組大鼠血清TC含量明顯降低，HDL含量明顯升高，差異均有統計學意義(t=6.868、3.369，P＜0.05)(圖 1)。
圖1
3組大鼠血清TC和HDL含量比較。*與CON組比較，P＜0.05；#與DM組比較，P＜0.05
光學顯微鏡觀察發現，CON組大鼠視網膜各層結構清晰，細胞排列整齊、形態正常(圖 2A)；DM組大鼠視網膜各層結構變薄，細胞排列紊亂，細胞核腫脹，部分血管明顯擴張(圖 2B)；NA組大鼠視網膜結構整齊，細胞排列漸規則(圖 2C)。
圖2
大鼠視網膜光學顯微鏡像。 2A.CON組，視網膜結構完整，細胞排列整齊；2B.DM組，視網膜各層結構變薄，細胞排列紊亂；2C. NA組，視網膜結構清晰，細胞排列整齊，水腫減輕 HE ×200
熒光顯微鏡觀察發現，CON組大鼠視網膜血管結 構清晰，視網膜血管走形正常，未見熒光滲漏(圖 3A)；明顯減輕，血管紆曲擴張均不明顯(圖 3C)。DM組EB平均滲漏量較CON組明顯增高，差異有統計學意義(t=24.712，P＜0.05)。NA組EB平均滲漏量較DM組明顯減少，差異有統計學意義(t=16.414,P＜0.05)(圖 4)。
圖3
大鼠視網膜鋪片熒光 顯微鏡像。3A. CON組，視網膜血管走形正常，未見EB滲漏 3B. DM組，可見EB自視網膜血管向外滲出(白箭)；3C. NA組，可見EB自視網膜血管向外滲出(白箭) ×200
圖4
3組EB平均滲漏量比較。*與CON組比較，P＜0.05；#與DM組比較，P＜0.05
RT-PCR檢測結果顯示，DM組大鼠視網膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA相對表達量較CON組明顯降低，差異有統計學意義(t=11.422、12.638、12.060，P＜0.05)。NA組大鼠視網膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA相對表達量較DM組明顯增高，差異有統計學意義(t=5.278、3.952、8.030，P＜0.05)。NA組大鼠視網膜GPR109A mRNA相對表達量較DM組明顯增高，差異有統計學意義(t=5.053,P＜0.05)(圖 5)。
圖5
各組大鼠視網膜Occludin、Claudin-5、ZO-1、GPR109A mRNA相對表達量比較。*與CON組比較，P＜0.05；#與DM組比較，P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，DM組大鼠視網膜GPR109A、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量較CON組明顯增高，差異有統計學意義(t=4.915、11.106、6.582，P＜0.05)。NA組大鼠視網膜GPR109A蛋白相對表達量較DM組明顯增高，差異有統計學意義(t=5.806,P＜0.05)；IL-6、TNF-α蛋白相對表達量較DM組明顯降低，差異有統計學意義(t=10.131、5.017，P＜0.05)(圖 6)。
圖6
3組大鼠視網膜GPR109A、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量比較。*與CON組比較，P＜0.05；#與DM組比較，P＜0.05
3 討論
BRB在維持視網膜微血管完整性中起重要作用，它的破壞會引起DR的一系列改變，最終影響視力。而在DR中，視網膜組織相關蛋白的mRNA和蛋白水平表達下調是BRB功能障礙的主要機制。本研究結果顯示，與DM組比較，NA組大鼠視網膜結構整齊，細胞排列漸規則；視網膜血管滲漏明顯減輕，血管紆曲擴張均不明顯；視網膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA相對表達量明顯增高。說明煙酸可以有效改善大鼠視網膜組織結構及血管滲漏情況，同時增加Occludin、Claudin-5、ZO-1的表達。提示煙酸可以修復血管內皮，從而維持BRB功能的完整。
鼠和人體內存在一定的煙酸受體GPR109A，該受體介導了煙酸在脂肪組織抑制甘油三酯水解作用[8]。同時，GPR109A 高度表達在視網膜組織中，尤其是在視網膜色素上皮層，并且起到一定的病理生理作用[4]。有研究表明，GPR109A受體在DR中表達升高，并可對抗DR引起的炎癥反應[9]。由此我們推測煙酸或許可以通過激活煙酸受體GPR109A的表達來改善DR。IL-6屬于炎癥前細胞因子，在DR中顯著升高并在其病理過程中起重要作用，可致血管內皮細胞損傷及功能變化[10]。還可誘導血管內皮生長因子的升高，從而促進新生血管的形成以及血管滲透性的改變[11]。TNF-α是一種主要由巨噬細胞和活化單核細胞產生的具有廣泛生物活性的細胞因子，具有極強的生物學效應。有學者認為，TNF-α參與機體的多種反應，在DR患者視網膜中顯著升高并通過增加白細胞浸潤介導了一系列炎癥反應[12, 13]。與此同時，TNF-α能顯著降低ZO-1的表達，共同破壞BRB以導致血管通透性的增加[14]。本研究結果顯示，DM組大鼠視網膜GPR109A mRNA表達量較CON組明顯增高，而NA組大鼠視網膜GPR109A mRNA表達量較DM進一步增高。DM組大鼠視網膜GPR109A、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量較CON組明顯增高；而NA組大鼠視網膜GPR109A蛋白相對表達量較DM進一步增高，但IL-6、TNF-α蛋白相對表達量卻較DM組明顯降低。說明經煙酸干預后GPR109A被大量激活，而被激活的GPR109A可以顯著抑制IL-6和TNF-α的表達，從而起到抑制由DR引起的炎癥反應，改善BRB的破壞程度以及血管通透性，以達到延緩DR發展的作用。但是具體相應的調節機制還需進一步研究。
血視網膜屏障(BRB)損傷導致的視網膜血管通透性增加是非增生型糖尿病視網膜病變(DR)的病理特征以及視力喪失的主要原因[1]。DR發生發展過程中，各種炎癥因子相互作用可影響BRB的完整性[2]。作為一種調脂藥物，煙酸可降低總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)，升高高密度脂蛋白(HDL)；并且通過煙酸受體G蛋白偶聯受體109A(GPR109A)在脂肪組織中抑制甘油三脂水解，從而具有改善血管內皮功能，降低血管通透性的作用[3]。研究發現，GPR109A存在于視網膜上并且在DR發生發展過程中發揮重要作用[4]。但煙酸能否通過視網膜中的GPR109A而影響DR的BRB卻少有報道。為此，我們觀察探討了煙酸對糖尿病大鼠BRB的影響及其機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
6～8 周齡、體重210～250 g的無特定病原級雄性Wistar大鼠(北京維通利華實驗動物有限公司提供)60只用于本研究。實驗動物喂養、使用以及相關操作嚴格遵循動物實驗倫理規范以及天津醫科大學實驗動物管理倫理委員會的相關規定。以標準顆粒飼養于標準化動物房，自由飲水攝食，室溫22~24℃，相對濕度40%~60%。適應性飼養1周后用于實驗。
隨機數字表法將大鼠分為空白對照組(CON組)、糖尿病模型對照組(DM組)和煙酸處理組(NA組)，每組20只。CON組大鼠僅注射檸檬酸鹽緩沖液。DM組、NA組大鼠建立糖尿病模型[5]。建模成功后第7天，NA組大鼠以40 mg/kg的劑量灌胃給予煙酸，1次/d，持續灌胃3個月。CON組、DM組大鼠正常喂食水。
于NA組大鼠灌胃3個月后，3組大鼠均于內眥處取血，采用自動生化分析儀檢測血清TC、HDL水平。
于NA組大鼠灌胃3個月后，各組取4只大鼠，10%水合氯醛麻醉處死，摘取眼球制備石蠟切片。連續4 μm切片，進行常規蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。
于NA組大鼠灌胃3個月后，各組取3只大鼠，以45 mg/kg的劑量尾靜脈注射2% 伊凡思藍(EB)溶液，循環2 h。處死大鼠，摘取眼球，置于濃度為4%多聚甲醛溶液中固定2 h。手術顯微鏡下除去角膜、虹膜，娩出晶狀體和玻璃體，完整分離出視網膜，平鋪于載玻片上，封片，立即置于激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下觀察、照相。各組取6只大鼠，EB染色滲漏分析法[6]檢測大鼠視網膜血管滲漏性，分別測定其在波長為620、740 nm的吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值。共測3次，取其平均值。
于NA組大鼠灌胃3個月后，各組取3只大鼠，檢測大鼠視網膜中閉合蛋白(Occludin)、封閉蛋白(Claudin)-5、緊密連接蛋白(ZO)-1、GPR109A的mRNA相對表達量。采用Trizol法提取視網膜總RNA，ND-1000微量紫外可見分光光度計檢測RNA濃度。根據引物設計原則，由上海生工設計并合成針對大鼠的β-肌動蛋白(actin)、Occludin、Claudin-5、ZO-1、 GPR109A的特異性引物。配置聚合酶鏈反應(PCR)體系，將反應板放入7700型熒光定量逆轉錄PCR(RT-PCR)儀進行擴增[7]。
采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測大鼠視 網膜中GPR109A、白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)蛋白相對表達量。取-80℃凍存視網膜組織，于細胞裂解液中研磨，取上清液行視網膜總蛋白定量后，行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入GPR109A(1:500)、IL-6(1:1000)、 TNF-α(1:1000)、β-actin(1:1000)抗體孵育過夜，辣根過氧化酶標記的二抗(1:5000)37℃ 孵育1 h。 應用 Bio-Rad 公司的Quantity One 4.4.0 分析軟件測定每一個目的條帶及其對應的內參β-actin灰度值。按照相對灰度值＝目的條帶灰度值/同一樣品β-actin 的灰度值計算每個樣品相應指標的灰度值，以此代表目的蛋白的表達水平。
采用SPSS 17.0統計學軟件進行統計分析，計量指標數據資料經Kolmogorov-Smirnov檢驗呈正態分布，以均數±標準差(
2 結果
3組大鼠血清TC、HDL含量比較，差異均有統計學意義(F=22.273、13.306，P＜0.05)。與CON組比較，DM組大鼠血清TC含量明顯升高，HDL含量明顯降低，差異均有統計學意義(t=4.034、5.831，P＜0.05)。與DM組比較，NA組大鼠血清TC含量明顯降低，HDL含量明顯升高，差異均有統計學意義(t=6.868、3.369，P＜0.05)(圖 1)。
圖1
3組大鼠血清TC和HDL含量比較。*與CON組比較，P＜0.05；#與DM組比較，P＜0.05
光學顯微鏡觀察發現，CON組大鼠視網膜各層結構清晰，細胞排列整齊、形態正常(圖 2A)；DM組大鼠視網膜各層結構變薄，細胞排列紊亂，細胞核腫脹，部分血管明顯擴張(圖 2B)；NA組大鼠視網膜結構整齊，細胞排列漸規則(圖 2C)。
圖2
大鼠視網膜光學顯微鏡像。 2A.CON組，視網膜結構完整，細胞排列整齊；2B.DM組，視網膜各層結構變薄，細胞排列紊亂；2C. NA組，視網膜結構清晰，細胞排列整齊，水腫減輕 HE ×200
熒光顯微鏡觀察發現，CON組大鼠視網膜血管結 構清晰，視網膜血管走形正常，未見熒光滲漏(圖 3A)；明顯減輕，血管紆曲擴張均不明顯(圖 3C)。DM組EB平均滲漏量較CON組明顯增高，差異有統計學意義(t=24.712，P＜0.05)。NA組EB平均滲漏量較DM組明顯減少，差異有統計學意義(t=16.414,P＜0.05)(圖 4)。
圖3
大鼠視網膜鋪片熒光 顯微鏡像。3A. CON組，視網膜血管走形正常，未見EB滲漏 3B. DM組，可見EB自視網膜血管向外滲出(白箭)；3C. NA組，可見EB自視網膜血管向外滲出(白箭) ×200
圖4
3組EB平均滲漏量比較。*與CON組比較，P＜0.05；#與DM組比較，P＜0.05
RT-PCR檢測結果顯示，DM組大鼠視網膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA相對表達量較CON組明顯降低，差異有統計學意義(t=11.422、12.638、12.060，P＜0.05)。NA組大鼠視網膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA相對表達量較DM組明顯增高，差異有統計學意義(t=5.278、3.952、8.030，P＜0.05)。NA組大鼠視網膜GPR109A mRNA相對表達量較DM組明顯增高，差異有統計學意義(t=5.053,P＜0.05)(圖 5)。
圖5
各組大鼠視網膜Occludin、Claudin-5、ZO-1、GPR109A mRNA相對表達量比較。*與CON組比較，P＜0.05；#與DM組比較，P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，DM組大鼠視網膜GPR109A、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量較CON組明顯增高，差異有統計學意義(t=4.915、11.106、6.582，P＜0.05)。NA組大鼠視網膜GPR109A蛋白相對表達量較DM組明顯增高，差異有統計學意義(t=5.806,P＜0.05)；IL-6、TNF-α蛋白相對表達量較DM組明顯降低，差異有統計學意義(t=10.131、5.017，P＜0.05)(圖 6)。
圖6
3組大鼠視網膜GPR109A、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量比較。*與CON組比較，P＜0.05；#與DM組比較，P＜0.05
3 討論
BRB在維持視網膜微血管完整性中起重要作用，它的破壞會引起DR的一系列改變，最終影響視力。而在DR中，視網膜組織相關蛋白的mRNA和蛋白水平表達下調是BRB功能障礙的主要機制。本研究結果顯示，與DM組比較，NA組大鼠視網膜結構整齊，細胞排列漸規則；視網膜血管滲漏明顯減輕，血管紆曲擴張均不明顯；視網膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA相對表達量明顯增高。說明煙酸可以有效改善大鼠視網膜組織結構及血管滲漏情況，同時增加Occludin、Claudin-5、ZO-1的表達。提示煙酸可以修復血管內皮，從而維持BRB功能的完整。
鼠和人體內存在一定的煙酸受體GPR109A，該受體介導了煙酸在脂肪組織抑制甘油三酯水解作用[8]。同時，GPR109A 高度表達在視網膜組織中，尤其是在視網膜色素上皮層，并且起到一定的病理生理作用[4]。有研究表明，GPR109A受體在DR中表達升高，并可對抗DR引起的炎癥反應[9]。由此我們推測煙酸或許可以通過激活煙酸受體GPR109A的表達來改善DR。IL-6屬于炎癥前細胞因子，在DR中顯著升高并在其病理過程中起重要作用，可致血管內皮細胞損傷及功能變化[10]。還可誘導血管內皮生長因子的升高，從而促進新生血管的形成以及血管滲透性的改變[11]。TNF-α是一種主要由巨噬細胞和活化單核細胞產生的具有廣泛生物活性的細胞因子，具有極強的生物學效應。有學者認為，TNF-α參與機體的多種反應，在DR患者視網膜中顯著升高并通過增加白細胞浸潤介導了一系列炎癥反應[12, 13]。與此同時，TNF-α能顯著降低ZO-1的表達，共同破壞BRB以導致血管通透性的增加[14]。本研究結果顯示，DM組大鼠視網膜GPR109A mRNA表達量較CON組明顯增高，而NA組大鼠視網膜GPR109A mRNA表達量較DM進一步增高。DM組大鼠視網膜GPR109A、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量較CON組明顯增高；而NA組大鼠視網膜GPR109A蛋白相對表達量較DM進一步增高，但IL-6、TNF-α蛋白相對表達量卻較DM組明顯降低。說明經煙酸干預后GPR109A被大量激活，而被激活的GPR109A可以顯著抑制IL-6和TNF-α的表達，從而起到抑制由DR引起的炎癥反應，改善BRB的破壞程度以及血管通透性，以達到延緩DR發展的作用。但是具體相應的調節機制還需進一步研究。
