引用本文： 李晶艷, 田敏, 張思遠, 韓佩晏, 黃棋, 呂紅彬. 叔丁基對苯二酚對2型糖尿病大鼠視網膜核因子E2相關因子、血紅素氧合酶1表達的影響. 中華眼底病雜志, 2015, 31(6): 581-585. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.06.017 復制
高血糖引起的活性氧簇(ROS)增多在糖尿病視網膜病變(DR)的發病中起重要作用[1]。核因子E2相關因子(Nrf2)/抗氧化反應元件(ARE)信號通路是調節機體氧化還原狀態的關鍵，其激活可誘導抗氧化蛋白、抗炎因子的上調，減輕機體氧化應激(OS)損傷[2]。血紅素氧合酶1(HO-1)是一種抗氧化蛋白，具有抗氧化、抗炎、抑制細胞凋亡等作用[3]。叔丁基對苯二酚(tBHQ)是Nrf2/ARE信號通路的強誘導劑[4]，可提高糖尿病(DM)小鼠腎臟組織中Nrf2的表達，HO-1的表達也明顯增強，且DM小鼠腎臟的OS損傷減輕[5]。但有關tBHQ與DR有無關系目前尚不明確。為此，我們觀察了不同時間節點tBHQ對DM大鼠視網膜Nrf2/ARE信號通路的影響，以探討tBHQ對DR有無保護作用及其相關機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
鏈脲佐菌素(STZ, 美國Sigma公司)；tBHQ(美國Acros公司)；兔抗大鼠Nrf2、HO-1多克隆抗體(美國Bioworld公司)；Nrf2、HO-1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物序列(上海生工生物有限公司)；提取總RNA試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、SYBR GreenⅠ染料(日本寶生物工程有限公司)；血糖儀(德國羅氏公司)；熒光定量PCR儀CFX96(美國BIO-RAD公司)；Leica生物顯微鏡(德國Leica公司；高速冷凍離心機(德國EPPENDORF公司)。
雄性Sprague Dawley大鼠60只，4周齡，體重180～200 g，四川醫科大學動物實驗中心提供。適應性喂養7 d后隨機抽取20只大鼠為正常對照組(NC組)，其余40只大鼠為造模組。NC組大鼠給予基礎飼料喂養；造模組大鼠給予高脂高糖飼料喂養。1個月后，造模組大鼠腹腔注射30 mg/kg劑量STZ制作2型DM模型[6, 7]；7 d后經尾靜脈采血檢測空腹血糖＞16.7 mmol/L者視為造模成功。NC組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。造模組剔除血糖恢復鼠5只，隨機分為DM組、tBHQ組，分別為17、18只大鼠。造模成功后7 d，tBHQ組大鼠給予添加1%tBHQ的高脂高糖飼料喂養[8, 9]；NC組、DM組大鼠飼養方法不變。剔除飼養過程死亡大鼠，最終NC組、DM組、tBHQ組分別為20、16、16只大鼠納入研究。tBHQ喂養后4、12周，NC組、DM組、tBHQ組大鼠過量麻醉處死，迅速摘除各組6只大鼠右眼球，制成眼杯。采用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察視網膜組織結構。采用免疫組織化學染色法檢測視網膜中Nrf2、HO-1蛋白表達。應用Leica DM4000B顯微鏡及Image-Pro Plus圖像分析系統分析Nrf2、HO-1蛋白表達情況。顯微鏡下觀察，以細胞漿出現棕黃色顆粒或棕褐色為陽性表達。隨機選取各組10張切片，每張切片高倍鏡下選取3個視網膜視野范圍內顏色反應區域，測定單位面積著色部位的平均吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值，并對各組平均值進行比較。重復測量3次取平均值。
熒光定量PCR測定大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1 mRNA表達。取tBHQ組、NC組、DM組大鼠剩余眼球視網膜各10份，總RNA試劑盒提取各組總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，建立SYBR GreenⅠ熒光定量PCR擴增反應體系，PCR引物[Nrf2引物序列107堿基對(bp)、HO-1引物序列129bp]、cDNA模板、SYBR GeenⅠ染料、單蒸水進行PCR擴增。以相同的反應體系，同時進行內參GAPDH的熒光定量檢測。結果使用比較Ct值法分析。
SPSS 17.0統計學軟件進行分析統計分析。所有數據以均數±標準差(
2 結果
光學顯微鏡觀察，4周時NC組大鼠視網膜組織結構清晰，未見明顯病理改變(圖 1A)；DM組大鼠視網膜細胞排列稍紊亂，內外核層稍融合，可見不同程度細胞水腫(圖 1B)；tBHQ組大鼠視網膜細胞排列較整齊，個別細胞可見輕度水腫(圖 1C)。12周時NC組大鼠視網膜各層結構基本正常，排列基本整齊，其余未見明顯病理變化(圖 1D)；DM組大鼠視網膜組織結構排列疏松，內外核層排列紊亂，細胞水腫明顯(圖 1E)；tBHQ組大鼠視網膜組織結構較清晰，部分細胞水腫，其余未見明顯異常(圖 1F)。
圖1
各組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像。4周：1A.NC組，視網膜組織結構排列正常(黑箭)；1B.DM組，視網膜細胞排列稍紊亂層間偶伴融合(黑箭)；1C.tBHQ組，視網膜細胞結構較整齊，可見個別細胞水腫(黑箭)。12周：1D.NC組，視網膜組織結構基本正常；1E.DM組，視網膜細胞水腫明顯，排列疏松紊亂(黑箭)；1F.tBHQ組，視網膜細胞排列較4周時組紊亂，水腫細胞增多(黑箭) HE×400
4、12周時NC組大鼠視網膜組織中可見少量Nrf2和極少量HO-1陽性表達點。Nrf2主要分布于視網膜神經節細胞(RGC)層、內叢狀層(IPL)；HO-1主要分布于內核層(INL)(圖 2, 3)。DM組、tBHQ組大鼠視網膜均可見較多Nrf2、HO-1陽性表達點，主要分布于INL、RGC層、IPL。但tBHQ組大鼠視網膜Nrf2陽性表達點數量較DM組明顯增加(圖 4～7)。
圖2
NC組大鼠視網膜組織Nrf2表達光學顯微鏡像。2A.4周；2B.12周。視網膜組織中可見少量Nrf2陽性表達點(黑箭)免疫組織化學×400 ??圖 3NC組大鼠視網膜組織HO-1表達光學顯微鏡像。3A.4周；3B.12周。視網膜組織中可見極少量HO-1陽性表達點(黑箭)免疫組織化學×400??圖 4 DM組大鼠視網膜組織Nrf2表達光學顯微鏡像。4A.4周；4B.12周。視網膜組織中可見較多Nrf2陽性表達點(黑箭)免疫組織化學×400??圖 5DM組大鼠視網膜組織HO-1表達光學顯微鏡像。5A.4周；5B.12周。視網膜組織中可見較多HO-1陽性表達點(黑箭)免疫組織化學×400??圖 6 tBHQ組大鼠視網膜組織Nrf2表達光學顯微鏡像。6A.4周；6B.12周。視網膜組織中Nrf2陽性表達點數量及陽性程度明顯增加(黑箭)免疫組織化學×400??圖 7 tBHQ組大鼠視網膜組織HO-1表達光學顯微鏡像。7A.4周；7B.12周。視網膜組織中HO-1陽性表達點數量及程度明顯增加(黑箭)免疫組織化學×400
4、12周時DM組大鼠視網膜中Nrf2(t=3.115、3.781)、HO-1(t=3.485、3.785)蛋白表達較NC組增多，差異均有統計學意義(P＜0.01)。tBHQ組大鼠視網膜中Nrf2(t=2.473、2.576)、HO-1(t=2.785、2.879)蛋白表達較DM組增多，差異有統計學意義(P＜0.05)。DM組組內比較，12周大鼠視網膜中Nrf2蛋白表達較4周時增高，差異有統計學意義(t=0.276, P＜0.05)；tBHQ組組內比較，12周大鼠視網膜中Nrf2(t=2.516)、HO-1(t=2.776)蛋白表達較4周時增高，差異有統計學意義(P＜0.05)(圖 8, 9)。
圖8
各組大鼠視網膜組織Nrf2蛋白表達平均A值比較。*與NC組比較，P＜0.01；#與DM組比較，P＜0.05；▲與4周時tBHQ組比較，P＜0.05；△與4周時DM組比較，P＜0.05??圖 9各組大鼠視網膜組織HO-1蛋白表達平均A值比較。*與NC組比較，P＜0.01；#與DM組比較，P＜0.05；▲與4周時tBHQ組比較，P＜0.05；△與4周時DM組比較，P＜0.05??圖 10各組大鼠視網膜組織Nrf2 mRNA表達比較。*與NC組比較，P＜0.01；#與DM組比較，P＜0.05；▲與4周時DM組比較，P＜0.05；△與4周時tBHQ組比較，P＜0.05??圖 11 各組大鼠視網膜組織HO-1 mRNA表達比較。*與NC組比較，P＜0.01；#與DM組比較，P＜0.05；△與4周時tBHQ組比較，P＜0.05
4、12周時DM組大鼠視網膜組織中Nrf2(t=4.758、4.285)、HO-1 mRNA(t=5.114、4.514)表達較NC組增多，差異有統計學意義(P＜0.05)；tBHQ組大鼠視網膜組織中Nrf2(t=5.133、4.976)、HO-1 mRNA(t=4.758、4.251)表達較DM組增多，差異有統計學意義(P＜0.05)。DM組組內比較，12周時視網膜組織中Nrf2 mRNA表達高于4周，差異有統計學意義(t=5.114, P＜0.05)；tBHQ組組內比較，12周時視網膜組織中Nrf2、HO-1 mRNA表達高于4周，差異有統計學意義(t=4.292、4.974, P＜0.05)(圖 10, 11)。
3 討論
相關研究表明，早期DM大鼠視網膜抗OS損傷能力增強以對抗高糖環境引起的ROS增多，但20周時DM大鼠抗OS損傷能力受損，從而發生OS損傷[10]。本研究采用免疫組織化學染色、熒光定量PCR的方法對DM大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1蛋白進行測定了解DM大鼠抗OS損傷能力，結果表明NC組大鼠視網膜各層僅有極少量Nrf2、HO-1表達；4周時，DM組Nrf2、HO-1陽性表達增多；12周時，Nrf2陽性表達在RGC層、INL、IPL進一步增高，而HO-1陽性表達則較4周時表達減少。說明DM早期機體產生了過多的ROS，抗氧化Nrf2/ARE信號通路被激活，機體Nrf2、HO-1表達增多，起到減輕OS損傷的作用；到12周時DM機體抗氧化防御系統已經受損，氧化還原平衡狀態被打破，機體HO-1表達降低，從而發生OS損傷。熒光定量PCR結果與免疫組織化學染色結果一致。同時，本研究結果顯示在DM大鼠模型中Nrf2、HO-1的表達量在時間上具有不一致性。
tBHQ作為Nrf2/ARE信號通路誘導劑，能通過一系列機制使Nrf2發生磷酸化并與胞漿蛋白Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1解耦聯、轉移入核內，與肌腱膜纖維肉瘤蛋白(Maf)結合成異二聚體，進而與ARE識別并結合，激活Nrf2/ARE信號通路，從而啟動HO-1基因的表達[4, 11]，有效減輕ROS引起的OS損傷。Shih等[12]通過對小鼠大腦皮質缺血再灌注損傷研究發現，1%tBHQ喂養Nrf2+/+小鼠24 h和4周后，大腦皮質中HO-1表達增強，缺血再灌注損傷減輕；而在Nrf2-/-小鼠中未見此現象。Chen等[13]對tBHQ作用于人支氣管上皮細胞進行了觀察，發現tBHQ能增加細胞中游離鋅濃度，從而促進Nrf2磷酸化，進一步誘導HO-1表達。田敏等[14]使用添加1%5, 6-二氫環戊烯并1, 2-二硫雜環戊烯-3-硫酮的飼料喂養2型DM大鼠，結果顯示大鼠視網膜Nrf2、HO-1表達增加，同時，視網膜組織OS損傷減輕。本研究使用添加1%tBHQ的飼料喂養DM大鼠，我們觀察到，在tBHQ干預后4周，大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1表達增加，高于DM組；干預后12周，大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1較4周時表達更高，同時亦高于DM組；且HE染色結果提示tBHQ組大鼠視網膜病理改變明顯輕于對應時間節點的DM組。以上均表明tBHQ干預可有效誘導視網膜組織中Nrf2及HO-1的表達，從而增強DM機體抗OS損傷能力。
本研究結果顯示，12周時，tBHQ組大鼠血糖低于DM組，說明tBHQ干預可以降低血糖。其機制可能為隨著tBHQ作用時間的延長，可減輕胰島β細胞OS損傷，使胰島素分泌水平基本維持在正常，從而起到降低血糖的作用[15]。
tBHQ干預可誘導DM機體視網膜組織Nrf2、HO-1的表達增加，增強視網膜組織抗OS損傷能力，減輕視網膜組織病理改變并降低血糖，提示tBHQ可能成為一種有效的抗視網膜OS損傷的保護劑。但本研究不足是未設計不同劑量tBHQ組；沒有進一步分析大鼠視網膜中Nrf2、HO-1在8、20周的表達情況。我們下一步將設計更詳細的觀察指標，同時對tBHQ長期應用副作用進行研究。
高血糖引起的活性氧簇(ROS)增多在糖尿病視網膜病變(DR)的發病中起重要作用[1]。核因子E2相關因子(Nrf2)/抗氧化反應元件(ARE)信號通路是調節機體氧化還原狀態的關鍵，其激活可誘導抗氧化蛋白、抗炎因子的上調，減輕機體氧化應激(OS)損傷[2]。血紅素氧合酶1(HO-1)是一種抗氧化蛋白，具有抗氧化、抗炎、抑制細胞凋亡等作用[3]。叔丁基對苯二酚(tBHQ)是Nrf2/ARE信號通路的強誘導劑[4]，可提高糖尿病(DM)小鼠腎臟組織中Nrf2的表達，HO-1的表達也明顯增強，且DM小鼠腎臟的OS損傷減輕[5]。但有關tBHQ與DR有無關系目前尚不明確。為此，我們觀察了不同時間節點tBHQ對DM大鼠視網膜Nrf2/ARE信號通路的影響，以探討tBHQ對DR有無保護作用及其相關機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
鏈脲佐菌素(STZ, 美國Sigma公司)；tBHQ(美國Acros公司)；兔抗大鼠Nrf2、HO-1多克隆抗體(美國Bioworld公司)；Nrf2、HO-1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物序列(上海生工生物有限公司)；提取總RNA試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、SYBR GreenⅠ染料(日本寶生物工程有限公司)；血糖儀(德國羅氏公司)；熒光定量PCR儀CFX96(美國BIO-RAD公司)；Leica生物顯微鏡(德國Leica公司；高速冷凍離心機(德國EPPENDORF公司)。
雄性Sprague Dawley大鼠60只，4周齡，體重180～200 g，四川醫科大學動物實驗中心提供。適應性喂養7 d后隨機抽取20只大鼠為正常對照組(NC組)，其余40只大鼠為造模組。NC組大鼠給予基礎飼料喂養；造模組大鼠給予高脂高糖飼料喂養。1個月后，造模組大鼠腹腔注射30 mg/kg劑量STZ制作2型DM模型[6, 7]；7 d后經尾靜脈采血檢測空腹血糖＞16.7 mmol/L者視為造模成功。NC組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。造模組剔除血糖恢復鼠5只，隨機分為DM組、tBHQ組，分別為17、18只大鼠。造模成功后7 d，tBHQ組大鼠給予添加1%tBHQ的高脂高糖飼料喂養[8, 9]；NC組、DM組大鼠飼養方法不變。剔除飼養過程死亡大鼠，最終NC組、DM組、tBHQ組分別為20、16、16只大鼠納入研究。tBHQ喂養后4、12周，NC組、DM組、tBHQ組大鼠過量麻醉處死，迅速摘除各組6只大鼠右眼球，制成眼杯。采用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察視網膜組織結構。采用免疫組織化學染色法檢測視網膜中Nrf2、HO-1蛋白表達。應用Leica DM4000B顯微鏡及Image-Pro Plus圖像分析系統分析Nrf2、HO-1蛋白表達情況。顯微鏡下觀察，以細胞漿出現棕黃色顆粒或棕褐色為陽性表達。隨機選取各組10張切片，每張切片高倍鏡下選取3個視網膜視野范圍內顏色反應區域，測定單位面積著色部位的平均吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值，并對各組平均值進行比較。重復測量3次取平均值。
熒光定量PCR測定大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1 mRNA表達。取tBHQ組、NC組、DM組大鼠剩余眼球視網膜各10份，總RNA試劑盒提取各組總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，建立SYBR GreenⅠ熒光定量PCR擴增反應體系，PCR引物[Nrf2引物序列107堿基對(bp)、HO-1引物序列129bp]、cDNA模板、SYBR GeenⅠ染料、單蒸水進行PCR擴增。以相同的反應體系，同時進行內參GAPDH的熒光定量檢測。結果使用比較Ct值法分析。
SPSS 17.0統計學軟件進行分析統計分析。所有數據以均數±標準差(
2 結果
光學顯微鏡觀察，4周時NC組大鼠視網膜組織結構清晰，未見明顯病理改變(圖 1A)；DM組大鼠視網膜細胞排列稍紊亂，內外核層稍融合，可見不同程度細胞水腫(圖 1B)；tBHQ組大鼠視網膜細胞排列較整齊，個別細胞可見輕度水腫(圖 1C)。12周時NC組大鼠視網膜各層結構基本正常，排列基本整齊，其余未見明顯病理變化(圖 1D)；DM組大鼠視網膜組織結構排列疏松，內外核層排列紊亂，細胞水腫明顯(圖 1E)；tBHQ組大鼠視網膜組織結構較清晰，部分細胞水腫，其余未見明顯異常(圖 1F)。
圖1
各組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像。4周：1A.NC組，視網膜組織結構排列正常(黑箭)；1B.DM組，視網膜細胞排列稍紊亂層間偶伴融合(黑箭)；1C.tBHQ組，視網膜細胞結構較整齊，可見個別細胞水腫(黑箭)。12周：1D.NC組，視網膜組織結構基本正常；1E.DM組，視網膜細胞水腫明顯，排列疏松紊亂(黑箭)；1F.tBHQ組，視網膜細胞排列較4周時組紊亂，水腫細胞增多(黑箭) HE×400
4、12周時NC組大鼠視網膜組織中可見少量Nrf2和極少量HO-1陽性表達點。Nrf2主要分布于視網膜神經節細胞(RGC)層、內叢狀層(IPL)；HO-1主要分布于內核層(INL)(圖 2, 3)。DM組、tBHQ組大鼠視網膜均可見較多Nrf2、HO-1陽性表達點，主要分布于INL、RGC層、IPL。但tBHQ組大鼠視網膜Nrf2陽性表達點數量較DM組明顯增加(圖 4～7)。
圖2
NC組大鼠視網膜組織Nrf2表達光學顯微鏡像。2A.4周；2B.12周。視網膜組織中可見少量Nrf2陽性表達點(黑箭)免疫組織化學×400 ??圖 3NC組大鼠視網膜組織HO-1表達光學顯微鏡像。3A.4周；3B.12周。視網膜組織中可見極少量HO-1陽性表達點(黑箭)免疫組織化學×400??圖 4 DM組大鼠視網膜組織Nrf2表達光學顯微鏡像。4A.4周；4B.12周。視網膜組織中可見較多Nrf2陽性表達點(黑箭)免疫組織化學×400??圖 5DM組大鼠視網膜組織HO-1表達光學顯微鏡像。5A.4周；5B.12周。視網膜組織中可見較多HO-1陽性表達點(黑箭)免疫組織化學×400??圖 6 tBHQ組大鼠視網膜組織Nrf2表達光學顯微鏡像。6A.4周；6B.12周。視網膜組織中Nrf2陽性表達點數量及陽性程度明顯增加(黑箭)免疫組織化學×400??圖 7 tBHQ組大鼠視網膜組織HO-1表達光學顯微鏡像。7A.4周；7B.12周。視網膜組織中HO-1陽性表達點數量及程度明顯增加(黑箭)免疫組織化學×400
4、12周時DM組大鼠視網膜中Nrf2(t=3.115、3.781)、HO-1(t=3.485、3.785)蛋白表達較NC組增多，差異均有統計學意義(P＜0.01)。tBHQ組大鼠視網膜中Nrf2(t=2.473、2.576)、HO-1(t=2.785、2.879)蛋白表達較DM組增多，差異有統計學意義(P＜0.05)。DM組組內比較，12周大鼠視網膜中Nrf2蛋白表達較4周時增高，差異有統計學意義(t=0.276, P＜0.05)；tBHQ組組內比較，12周大鼠視網膜中Nrf2(t=2.516)、HO-1(t=2.776)蛋白表達較4周時增高，差異有統計學意義(P＜0.05)(圖 8, 9)。
圖8
各組大鼠視網膜組織Nrf2蛋白表達平均A值比較。*與NC組比較，P＜0.01；#與DM組比較，P＜0.05；▲與4周時tBHQ組比較，P＜0.05；△與4周時DM組比較，P＜0.05??圖 9各組大鼠視網膜組織HO-1蛋白表達平均A值比較。*與NC組比較，P＜0.01；#與DM組比較，P＜0.05；▲與4周時tBHQ組比較，P＜0.05；△與4周時DM組比較，P＜0.05??圖 10各組大鼠視網膜組織Nrf2 mRNA表達比較。*與NC組比較，P＜0.01；#與DM組比較，P＜0.05；▲與4周時DM組比較，P＜0.05；△與4周時tBHQ組比較，P＜0.05??圖 11 各組大鼠視網膜組織HO-1 mRNA表達比較。*與NC組比較，P＜0.01；#與DM組比較，P＜0.05；△與4周時tBHQ組比較，P＜0.05
4、12周時DM組大鼠視網膜組織中Nrf2(t=4.758、4.285)、HO-1 mRNA(t=5.114、4.514)表達較NC組增多，差異有統計學意義(P＜0.05)；tBHQ組大鼠視網膜組織中Nrf2(t=5.133、4.976)、HO-1 mRNA(t=4.758、4.251)表達較DM組增多，差異有統計學意義(P＜0.05)。DM組組內比較，12周時視網膜組織中Nrf2 mRNA表達高于4周，差異有統計學意義(t=5.114, P＜0.05)；tBHQ組組內比較，12周時視網膜組織中Nrf2、HO-1 mRNA表達高于4周，差異有統計學意義(t=4.292、4.974, P＜0.05)(圖 10, 11)。
3 討論
相關研究表明，早期DM大鼠視網膜抗OS損傷能力增強以對抗高糖環境引起的ROS增多，但20周時DM大鼠抗OS損傷能力受損，從而發生OS損傷[10]。本研究采用免疫組織化學染色、熒光定量PCR的方法對DM大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1蛋白進行測定了解DM大鼠抗OS損傷能力，結果表明NC組大鼠視網膜各層僅有極少量Nrf2、HO-1表達；4周時，DM組Nrf2、HO-1陽性表達增多；12周時，Nrf2陽性表達在RGC層、INL、IPL進一步增高，而HO-1陽性表達則較4周時表達減少。說明DM早期機體產生了過多的ROS，抗氧化Nrf2/ARE信號通路被激活，機體Nrf2、HO-1表達增多，起到減輕OS損傷的作用；到12周時DM機體抗氧化防御系統已經受損，氧化還原平衡狀態被打破，機體HO-1表達降低，從而發生OS損傷。熒光定量PCR結果與免疫組織化學染色結果一致。同時，本研究結果顯示在DM大鼠模型中Nrf2、HO-1的表達量在時間上具有不一致性。
tBHQ作為Nrf2/ARE信號通路誘導劑，能通過一系列機制使Nrf2發生磷酸化并與胞漿蛋白Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1解耦聯、轉移入核內，與肌腱膜纖維肉瘤蛋白(Maf)結合成異二聚體，進而與ARE識別并結合，激活Nrf2/ARE信號通路，從而啟動HO-1基因的表達[4, 11]，有效減輕ROS引起的OS損傷。Shih等[12]通過對小鼠大腦皮質缺血再灌注損傷研究發現，1%tBHQ喂養Nrf2+/+小鼠24 h和4周后，大腦皮質中HO-1表達增強，缺血再灌注損傷減輕；而在Nrf2-/-小鼠中未見此現象。Chen等[13]對tBHQ作用于人支氣管上皮細胞進行了觀察，發現tBHQ能增加細胞中游離鋅濃度，從而促進Nrf2磷酸化，進一步誘導HO-1表達。田敏等[14]使用添加1%5, 6-二氫環戊烯并1, 2-二硫雜環戊烯-3-硫酮的飼料喂養2型DM大鼠，結果顯示大鼠視網膜Nrf2、HO-1表達增加，同時，視網膜組織OS損傷減輕。本研究使用添加1%tBHQ的飼料喂養DM大鼠，我們觀察到，在tBHQ干預后4周，大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1表達增加，高于DM組；干預后12周，大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1較4周時表達更高，同時亦高于DM組；且HE染色結果提示tBHQ組大鼠視網膜病理改變明顯輕于對應時間節點的DM組。以上均表明tBHQ干預可有效誘導視網膜組織中Nrf2及HO-1的表達，從而增強DM機體抗OS損傷能力。
本研究結果顯示，12周時，tBHQ組大鼠血糖低于DM組，說明tBHQ干預可以降低血糖。其機制可能為隨著tBHQ作用時間的延長，可減輕胰島β細胞OS損傷，使胰島素分泌水平基本維持在正常，從而起到降低血糖的作用[15]。
tBHQ干預可誘導DM機體視網膜組織Nrf2、HO-1的表達增加，增強視網膜組織抗OS損傷能力，減輕視網膜組織病理改變并降低血糖，提示tBHQ可能成為一種有效的抗視網膜OS損傷的保護劑。但本研究不足是未設計不同劑量tBHQ組；沒有進一步分析大鼠視網膜中Nrf2、HO-1在8、20周的表達情況。我們下一步將設計更詳細的觀察指標，同時對tBHQ長期應用副作用進行研究。
