引用本文： 王振華, 郭小奇, 陳利軍, 張如楠, 楊留勤, 武莉萍, 谷曉華. 苦參堿對葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、凋亡及放射敏感性的影響. 中華眼底病雜志, 2023, 39(10): 828-835. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20230907-00377 復制
葡萄膜黑色素瘤是成人常見眼部原發性惡性腫瘤，起病隱匿且極易發生肝臟轉移而導致預后不良[1-3]。早期可通過手術治療，晚期通常采用靶向和免疫治療，但均存在一定局限性，如長期用藥導致患者出現耐藥性、增加劑量導致不良反應過大、輔助藥物毒副作用較大等[4]。苦參堿是傳統中藥苦參的重要藥理活性成分，具有抗菌消炎、調節免疫、抗病毒、抗腫瘤等作用[5]；既往研究發現其可通過抑制癌細胞增殖，細胞周期阻滯，誘導凋亡以及逆轉耐藥等機制發揮抗腫瘤作用，在肝癌、乳腺癌、宮頸癌、胃癌中發揮重要作用[6-8]。此外，苦參堿可阻滯視網膜母細胞瘤（RB）停留在G0/G1期，誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖活性[9]。Zhao等[10]研究表明苦參堿降低RB對長春新堿的耐藥性，抑制細胞增殖。為此，本研究探討苦參堿對葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、凋亡以及放射敏感性的影響，以期為臨床后續研究抗癌輔助藥物提供新的依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要材料
人脈絡膜黑色素瘤MuM2B細胞株（中國科學院細胞研究所）；BALB/C小鼠（湖北貝恩特生物科技有限公司）；苦參堿純品（北京康納瑞生物科技有限公司）；RPMI培養基、10%胎牛血清（美國Hyclone公司）；青鏈霉素混合液（北京索萊寶生物科技有限公司）；噻唑藍（MTT）試劑盒（天津阿爾法生物科技有限公司）；凋亡試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）；細胞周期蛋白D（CyclinD）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（美國CST公司）。
1.2 體外實驗
細胞培養與分組。MuM2B細胞株常規復蘇，置于含10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素的RPMI培養基中培養，每2天更換一次培養液，0.25%胰酶消化液進行消化傳代，取第3代生長良好的對數生長期細胞，以濃度1×106個/ml、100 μl/孔接種于96孔板中，孵育24 h后分別加入濃度0.25、0.50、1.00、2.00 g/L的苦參堿，據此濃度分為4組，每組均設5個復孔；另設置5孔不加苦參堿作為對照組，其余培養條件與其他4組一致。
透射電子顯微鏡觀察細胞形態。MuM2B細胞加入苦參堿后繼續培養48 h，以離心半徑8 cm、3 000 r/min離心10 min，收集細胞，4℃、2.5%戊二醛固定2 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，1%鋨酸室溫固定2 h，PBS漂洗3次。常規脫水漂洗、滲透、包埋、超薄切片后2%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡下觀察拍照。
MTT比色法檢測細胞增殖和細胞X射線照射敏感性，即放射敏感性。細胞增殖：MuM2B細胞加入苦參堿分別培養24、48、72、96 h后，每孔加入MTT溶液20 μl，繼續培養4 h，二甲亞砜（DMSO）振蕩10 min，酶標儀測量各孔樣本在波長490 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，計算細胞存活率。細胞放射敏感性：MuM2B細胞接種于6孔板中，細胞貼壁后，分別給予0、2、4、6、8、10 Gy單次吸收劑量照射，每個劑量設置5個平行。照射條件為6 mV X射線，劑量率為300 cGy/min，源皮距100 cm。照射結束后封閉24 h，常規RPMI培養基培養，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=各濃度組A值/對照A值×100%。
流式細胞儀檢測細胞周期、細胞凋亡率。MuM2B細胞加入苦參堿后繼續培養48 h，0.25%胰蛋白酶消化，PBS漂洗2次，以離心半徑8 cm、3 000 r/min離心10 min沉淀細胞，預冷PBS重懸細胞，加入1 ml體積分數為70%的乙醇，吹打混勻，4℃固定12 h，離心，PBS漂洗2次，重懸細胞。細胞周期：加入碘化丙啶（PI）0.5 ml，37℃避光孵育30 min；細胞凋亡率：分別加入5 μl膜聯蛋白（Annexin）Ⅴ-異硫氰酸熒光素5 μl PI，避光染色10 min。流式細胞儀分別檢測細胞周期、細胞凋亡率；Modfit軟件分析各細胞周期的細胞百分比。
實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測細胞內CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量。收集各組細胞，Trizol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBR Green Super Mix試劑盒進行聚合酶鏈反應擴增。所用引物由廣州銳博生物科技有限公司合成（表1）。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40個循環。以GAPDH為內參照，2-△△CT法計算目的基因mRNA相對表達量。
表1
基因擴增和測序序列
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測細胞內CyclinD、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量。收集各組細胞，PBS洗滌，4 ℃，以離心半徑10 cm、14 000 r/min離心10 min，加入細胞/組織裂解液提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法蛋白定量，取50 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳，轉至聚偏氟乙烯膜上，5%牛血清白蛋白封閉2 h，洗膜后與特定一抗4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗，37 ℃孵育2 h，洗膜，化學發光試劑盒顯色，以GAPDH為內參照，凝膠成像系統掃描分析蛋白條帶，計算目的蛋白相對表達量。
1.3 體內實驗
BALB/C小鼠50只，鼠齡5～6周齡，體重15～17 g，湖北貝恩特生物科技有限公司提供[生產許可證號：SCXK（鄂）2021-0027]。本研究通過新鄉市中心醫院動物倫理委員審核（批準號：XXZX-KY-2020037）。
脈絡膜黑色素瘤移植瘤小鼠模型建立與分組。MuM2B細胞制成密度為5×106個/ml的細胞懸液，于小鼠前肢背部皮下注射100 μl，注射后7 d注射部位觸及小腫塊為建模成功。建模后小鼠隨機分為空白組以及苦參堿15、25、50、100 mg/kg組，每組均為10只小鼠。參照文獻[11]的方法，空白組小鼠瘤周皮下注射PBS；不同劑量苦參堿處理組小鼠瘤周皮下分別注射15、25、50、100 mg/kg苦參堿，1次/d，連續7 d。末次給藥2 h后，處死所有小鼠并剝離瘤體，稱取瘤體重量并測量其體積。
蘇木精-伊紅（HE）染色觀察小鼠腫瘤細胞形態變化。腫瘤組織置于含4%多聚甲醛中固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制作4 μm厚度的連續切片。HE染色，光學顯微鏡下觀察拍照。
1.4 統計學方法
采用SPSS22.0軟件行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 苦參堿使MuM2B細胞呈凋亡形態改變
透射電子顯微鏡觀察發現，對照組細胞結構正常，分布均勻，胞核、核仁較大，核仁不規則，細胞多為多邊形、圓形、梭形等；未見或少見核固縮。不同濃度苦參堿組隨濃度升高細胞核固縮逐漸增多，出現小片狀無細胞生長區，包漿濃縮，細胞形態明顯變化，胞質內出現較多大小不等的空泡（圖1）。
圖1
對照組、不同濃度苦參堿組細胞透射電子顯微鏡像（標尺：100 μm）
1A示對照組，可見核仁較大，邊界清晰，核染色質豐富；1B～1E分別示苦參堿0.25、0.50、1.00、2.00 g/L組，核仁變小，核濃縮，核染色質聚集，逐步分裂為碎片，形成凋亡小體
2.2 苦參堿降低MuM2B細胞增殖活性
MTT法檢測結果顯示，對照組、不同濃度苦參堿組不同作用時間（24、48、72、96 h）細胞存活率總體比較，差異有統計學意義（F=46.946、90.872、135.330、201.698，P=0.000）。其中，對照組與苦參堿0.25 g/L組不同作用時間（24、48、72、96 h）細胞存活率比較，差異均無統計學意義（t=0.365、0.205、0.299、0.202，P＞0.05）；與對照組比較，苦參堿0.50、1.00、2.00 g/L組細胞存活率隨苦參堿濃度升高及作用時間延長，細胞存活率逐漸降低，差異均有統計學意義（24 h：t=6.349、9.497、14.336；48 h：t=11.398、14.750、17.268；72 h：t=12.979、16.705、19.890；96 h：t=17.238、20.748、26.642；P＜0.05）（圖2）。
圖2
苦參堿不同濃度和作用時間對MuM2B細胞增殖的影響（n=3）
a同一作用時間，與對照組比較，
2.3 苦參堿阻滯MuM2B細胞周期并誘導細胞凋亡
流式細胞儀檢測結果顯示，對照組、不同濃度苦參堿組細胞周期總體比例比較，差異有統計學意義（F=54.833、35.823、25.011，P=0.000）。其中，與對照組比較，苦參堿0.25 g/L組細胞G0/G1期、G2/M期、S期細胞比例無顯著變化，差異無統計學意義（t=2.451、1.855、1.456，P＞0.05）；與對照組比較，苦參堿0.50、1.00、2.00 g/L組隨苦參堿濃度升高，G0/G1期細胞比例顯著升高（t=8.355、10.998、13.158，P＜0.05），G2/M期、S期細胞比例降低，差異均有統計學意義（G2/M期：t=4.732、7.088、8.768；S期：t=4.499、6.407、8.223；P＜0.05）（圖3）。
圖3
對照組與不同濃度苦參堿組細胞周期比例（n=3） a與對照組比較，P＜0.05；b與苦參堿0.25 g/L組比較，P＜0.05；c與苦參堿0.5 g/L組比較，P＜0.05；d與苦參堿1.00 g/L組比較，P＜0.05
對照組、不同濃度苦參堿組細胞凋亡率總體比較，差異有統計學意義（F=155.710，P=0.001）。其中，與對照組比較，苦參堿0.25、0.50、1.00、2.00 g/L組均隨苦參堿濃度升高，細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義（t=5.140、14.215、16.145、22.094，P＜0.05）（圖4）。
圖4
對照組與不同濃度苦參堿組細胞凋亡率比較（n=3）
a與對照組比較，
2.4 苦參堿可提高MuM2B細胞對放射線的敏感性
MTT法檢測結果顯示，同一照射劑量下，對照組、不同濃度苦參堿組細胞存活率總體比較，差異有統計學意義（F=47.071，P=0.000）。其中，與對照組比較，苦參堿0.25g/L組細胞存活率無顯著變化，差異無統計學意義（t=1.633，P＞0.05）；苦參堿0.50、1.00、2.00 g/L組隨苦參堿濃度升高細胞存活率顯著降低，差異有統計學意義（t=5.284、6.928、13.451，P＜0.05）（圖5）。
圖5
苦參堿對不同吸收劑量X線照射下MuM2B細胞存活率的影響（n=3）
2.5 苦參堿抑制MuM2B細胞增殖、凋亡相關基因表達
qRT-PCR檢測結果顯示，對照組、不同濃度苦參堿組細胞內CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量總體比較，差異有統計學意義（F=50.795、80.265、718.138，P=0.000）。其中，與對照組比較，苦參堿0.25 g/L組細胞中CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量無顯著變化，差異無統計學意義（t=2.118、1.837、3.008，P＞0.05）；與對照組比較，苦參堿0.50、1.00、2.00 g/L組隨苦參堿濃度升高，細胞中CyclinD（t=5.205、9.180、12.668）、Bcl-2（t=4.885、12.010、16.573）mRNA相對表達量逐漸降低，Bax（t=13.692、26.594、38.127） mRNA相對表達量逐漸升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖6）。
圖6
不同濃度苦參堿刺激濃度對細胞內CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA表達的影響（n=3） CyclinD：細胞周期蛋白D；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2；Bax：Bcl-2相關X蛋白；a與對照組比較，P＜0.05；b與苦參堿0.25 g/L組比較，P＜0.05；c與苦參堿0.5 g/L組比較，P＜0.05；d與苦參堿1.00 g/L組比較，P＜0.05
2.6 苦參堿抑制MuM2B細胞增殖、凋亡相關蛋白表達
Western blot檢測結果顯示，對照組、不同濃度苦參堿組細胞內CyclinD、Bcl-2、Bax 蛋白相對表達量總體比較，差異有統計學意義（F=20.945、35.116、34.067，P=0.000）。其中，與對照組比較，苦參堿0.25 g/L組細胞中CyclinD、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量無顯著變化，差異無統計學意義（t=0.490、0.680、1.386，P＞0.05）；與對照組比較，苦參堿0.50、1.00、2.00 g/L隨苦參堿濃度升高，細胞中CyclinD（t=2.976、5.495、7.746）、Bcl-2（t=4.254、6.725、10.376）蛋白相對表達量逐漸降低，Bax（t=5.347、7.733、9.122）蛋白相對表達量逐漸升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖7）。
圖7
不同濃度苦參堿對MuM2B細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響（n=3）
7A示電泳圖，A～E分別示對照組及苦參堿0.25、0.50、1.00、2.00 g/L組；7B示5組細胞內 CyclinD、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較 CyclinD：細胞周期蛋白D；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2；Bax：Bcl-2相關X蛋白；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶；a與對照組比較，
2.7 苦參堿抑制葡萄膜黑色素瘤體內生長
干預后，空白組及苦參堿15、25、50、100 mg/kg組小鼠腫瘤重量分別為（0.57±0.03）、（0.50±0.03）、（0.43±0.02）、（0.37±0.02）、（0.31±0.02）g；5組小鼠腫瘤重量總體比較，差異有統計學意義（F=176.333，P=0.000）。其中，與空白組比較，不同劑量苦參堿組小鼠腫瘤重量顯著降低，差異有統計學意義（t=5.217、12.279、17.541、22.804，P＜0.05）（圖8A，8B）。
圖8
不同濃度苦參堿對腫瘤的影響（n=10）
8A示空白組及苦參堿15、25、50、100 mg/kg組小鼠腫瘤大體標本；8B示5組小鼠腫瘤體量比較；8C示5組小鼠干預前后腫瘤體積比較 a與空白組比較，
干預前，空白組及苦參堿15、25、50、100 mg/kg組小鼠腫瘤體積分別為（71.84±3.49）、（72.85±3.40）、（71.22±3.28）、（70.62±3.06）、（70.41±3.40）mm3；5組小鼠腫瘤體積總體比較，差異無統計學意義（F=0.883，P＞0.05）。干預后，空白組及不同劑量苦參堿組小鼠腫瘤體積分別為（141.22±12.54）、（124.54±13.67）、（108.83±11.22）、（81.48±8.10）、（77.05±7.59）mm3；5組小鼠腫瘤體積比較，差異有統計學意義（F=63.837，P＜0.05）。其中，與空白組比較，不同劑量苦參堿組小鼠腫瘤體積顯著縮小，差異有統計學意義（t=2.843、6.087、12.655、13.844，P＜0.05）（圖8C）。
光學顯微鏡觀察發現，空白組腫瘤細胞彌漫分布，呈圓形、橢圓形或不規則形狀，排列紊亂緊密，細胞核染色加深，核漿比增大，核分裂相多見；不同濃度苦參堿組腫瘤細胞數量減少，細胞界限模糊，核固縮，分裂象減少，出現大片壞死（圖9）。
圖9
空白組及不同劑量苦參堿組腫瘤組織光學顯微鏡像（蘇木精-伊紅染色，標尺：50 μm）
9A示空白組，細胞排列紊亂緊密，形態不規則，細胞核深染；9B～9E分別苦參堿15、25、50、100 mg/kg組，細胞數量減少，核固縮，可見大片壞死
3 討論
葡萄膜黑色素瘤是一種死亡率極高的惡性腫瘤，細胞惡性增殖、侵襲是導致疾病難以根治以及患者預后較差的根本原因[12]。目前其治療方式主要為放射治療，但由于葡萄膜黑色素瘤細胞增殖與侵襲能力較強，導致治療效果較差，影響患者生存質量。研究發現，癌細胞中多種生長因子均會對細胞放射線敏感性造成影響，如細胞增殖因子、凋亡因子等，最終導致患者死亡率高、生存率低以及預后差[13-14]。
中藥具有安全性高、價格低廉以及副作用低等特點，可通過多種途徑抑制腫瘤細胞增殖、轉移，降低腫瘤發生率[15]。有研究發現，木犀草素可抑制葡萄膜黑色素瘤中血管生成，發揮抗葡萄膜黑色素瘤作用[16]；小白菊內酯可抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖，誘導凋亡[17]。石蒜堿可引起葡萄膜黑色素瘤細胞S期阻滯，誘導細胞凋亡，從而發揮抗癌作用[18]。苦參堿作為一種臨床應用價值較高的中藥活性成分，在抗腫瘤中發揮著重要作用，能夠通過抵抗細胞周期進展，抑制細胞增殖以及誘導細胞凋亡等過程抑制腫瘤發生與發展，還可與其他放射治療（放療）、化學藥物治療（化療）藥物聯合使用，協同發揮抗腫瘤作用以及提高腫瘤細胞的放療敏感性，以發揮更好的治療效果[19-21]。前期研究表明，苦參堿在眼底疾病中具有一定作用，通過抑制血管內皮細胞增殖，改善糖尿病視網膜病理損傷[22]。
細胞持續不斷的分裂與增殖是腫瘤細胞進展迅速的重要原因之一，因此抑制細胞增殖，并誘導細胞凋亡是臨床治療惡性腫瘤的主要目的之一[23]。細胞凋亡是指程序性細胞絲死亡Bcl家族蛋白是常見的凋亡蛋白之一，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，當Bcl-2水平降低，Bax水平升高，細胞趨向凋亡[24]。CyclinD主要見于一些原發性惡性腫瘤，并在癌細胞中高表達，調節細胞周期，促進細胞增殖，臨床上常用于腫瘤早期診斷與預后診斷[25]。本研究結果顯示，不同濃度苦參堿處理后，MuM2B細胞形態改變，出現大量核固縮，存活率降低，凋亡率升高，G0/G1期細胞比例升高，G2/M期、S期細胞比例降低，CyclinD、Bcl-2表達顯著降低，Bax水平升高，表明苦參堿可通過下調CyclinD、Bcl-2表達，增加Bax表達，降低MuM2B細胞的存活率，提高凋亡率，且具有劑量效應，提示苦參堿具有抑制MuM2B細胞增殖、阻滯細胞周期進展并誘導凋亡的作用。本研究結果與史雪麗等[26]報道的馬錢子堿通過改變線粒體凋亡途徑中凋亡相關信號分子Bax及Bcl-2的表達，抑制黑色素瘤細胞增殖并促進細胞凋亡的結論具有一致性。
常規放療主要是通過促進腫瘤細胞重新氧合、細胞周期重新分布過程實現的，但在放療過程中部分腫瘤細胞會產生一定的放療抵抗性并進一步克隆增生更多的放療耐受細胞[27-28]。本研究結果顯示，不同濃度苦參堿處理后，細胞存活率降低，表明苦參堿處理后，MuM2B細胞對放療的敏感性增加，且具有劑量效應，提示苦參堿可有效增強MuM2B細胞的放療敏感性。另外，本研究體內實驗結果顯示，苦參堿可顯著抑制腫瘤生長，這與Zhang等[29]研究結果一致，表明苦參堿可抑制葡萄膜黑色素瘤生長。
本研究通過設置不同濃度的苦參堿處理MuM2B細胞，探討其對MuM2B細胞增殖、凋亡和放療敏感性的影響，發現苦參堿能夠有效抑制MuM2B細胞增殖、阻滯細胞周期并誘導其發生凋亡，增強其放療敏感性，為今后開發葡萄膜黑色素瘤新的治療藥物和放化療輔助藥物提供了新思路。
本研究存在的不足是苦參堿發揮抗葡萄膜黑色素瘤的主要成分和具體機制仍需進行深入研究；細胞增殖、凋亡機制復雜，涉及多條信號通路，本研究對細胞增殖、凋亡等相關蛋白表達的研究過于單一，今后研究尚需要進一步補充和完善。
葡萄膜黑色素瘤是成人常見眼部原發性惡性腫瘤，起病隱匿且極易發生肝臟轉移而導致預后不良[1-3]。早期可通過手術治療，晚期通常采用靶向和免疫治療，但均存在一定局限性，如長期用藥導致患者出現耐藥性、增加劑量導致不良反應過大、輔助藥物毒副作用較大等[4]。苦參堿是傳統中藥苦參的重要藥理活性成分，具有抗菌消炎、調節免疫、抗病毒、抗腫瘤等作用[5]；既往研究發現其可通過抑制癌細胞增殖，細胞周期阻滯，誘導凋亡以及逆轉耐藥等機制發揮抗腫瘤作用，在肝癌、乳腺癌、宮頸癌、胃癌中發揮重要作用[6-8]。此外，苦參堿可阻滯視網膜母細胞瘤（RB）停留在G0/G1期，誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖活性[9]。Zhao等[10]研究表明苦參堿降低RB對長春新堿的耐藥性，抑制細胞增殖。為此，本研究探討苦參堿對葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、凋亡以及放射敏感性的影響，以期為臨床后續研究抗癌輔助藥物提供新的依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要材料
人脈絡膜黑色素瘤MuM2B細胞株（中國科學院細胞研究所）；BALB/C小鼠（湖北貝恩特生物科技有限公司）；苦參堿純品（北京康納瑞生物科技有限公司）；RPMI培養基、10%胎牛血清（美國Hyclone公司）；青鏈霉素混合液（北京索萊寶生物科技有限公司）；噻唑藍（MTT）試劑盒（天津阿爾法生物科技有限公司）；凋亡試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）；細胞周期蛋白D（CyclinD）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（美國CST公司）。
1.2 體外實驗
細胞培養與分組。MuM2B細胞株常規復蘇，置于含10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素的RPMI培養基中培養，每2天更換一次培養液，0.25%胰酶消化液進行消化傳代，取第3代生長良好的對數生長期細胞，以濃度1×106個/ml、100 μl/孔接種于96孔板中，孵育24 h后分別加入濃度0.25、0.50、1.00、2.00 g/L的苦參堿，據此濃度分為4組，每組均設5個復孔；另設置5孔不加苦參堿作為對照組，其余培養條件與其他4組一致。
透射電子顯微鏡觀察細胞形態。MuM2B細胞加入苦參堿后繼續培養48 h，以離心半徑8 cm、3 000 r/min離心10 min，收集細胞，4℃、2.5%戊二醛固定2 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，1%鋨酸室溫固定2 h，PBS漂洗3次。常規脫水漂洗、滲透、包埋、超薄切片后2%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡下觀察拍照。
MTT比色法檢測細胞增殖和細胞X射線照射敏感性，即放射敏感性。細胞增殖：MuM2B細胞加入苦參堿分別培養24、48、72、96 h后，每孔加入MTT溶液20 μl，繼續培養4 h，二甲亞砜（DMSO）振蕩10 min，酶標儀測量各孔樣本在波長490 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，計算細胞存活率。細胞放射敏感性：MuM2B細胞接種于6孔板中，細胞貼壁后，分別給予0、2、4、6、8、10 Gy單次吸收劑量照射，每個劑量設置5個平行。照射條件為6 mV X射線，劑量率為300 cGy/min，源皮距100 cm。照射結束后封閉24 h，常規RPMI培養基培養，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=各濃度組A值/對照A值×100%。
流式細胞儀檢測細胞周期、細胞凋亡率。MuM2B細胞加入苦參堿后繼續培養48 h，0.25%胰蛋白酶消化，PBS漂洗2次，以離心半徑8 cm、3 000 r/min離心10 min沉淀細胞，預冷PBS重懸細胞，加入1 ml體積分數為70%的乙醇，吹打混勻，4℃固定12 h，離心，PBS漂洗2次，重懸細胞。細胞周期：加入碘化丙啶（PI）0.5 ml，37℃避光孵育30 min；細胞凋亡率：分別加入5 μl膜聯蛋白（Annexin）Ⅴ-異硫氰酸熒光素5 μl PI，避光染色10 min。流式細胞儀分別檢測細胞周期、細胞凋亡率；Modfit軟件分析各細胞周期的細胞百分比。
實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測細胞內CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量。收集各組細胞，Trizol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBR Green Super Mix試劑盒進行聚合酶鏈反應擴增。所用引物由廣州銳博生物科技有限公司合成（表1）。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40個循環。以GAPDH為內參照，2-△△CT法計算目的基因mRNA相對表達量。
表1
基因擴增和測序序列
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測細胞內CyclinD、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量。收集各組細胞，PBS洗滌，4 ℃，以離心半徑10 cm、14 000 r/min離心10 min，加入細胞/組織裂解液提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法蛋白定量，取50 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳，轉至聚偏氟乙烯膜上，5%牛血清白蛋白封閉2 h，洗膜后與特定一抗4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗，37 ℃孵育2 h，洗膜，化學發光試劑盒顯色，以GAPDH為內參照，凝膠成像系統掃描分析蛋白條帶，計算目的蛋白相對表達量。
1.3 體內實驗
BALB/C小鼠50只，鼠齡5～6周齡，體重15～17 g，湖北貝恩特生物科技有限公司提供[生產許可證號：SCXK（鄂）2021-0027]。本研究通過新鄉市中心醫院動物倫理委員審核（批準號：XXZX-KY-2020037）。
脈絡膜黑色素瘤移植瘤小鼠模型建立與分組。MuM2B細胞制成密度為5×106個/ml的細胞懸液，于小鼠前肢背部皮下注射100 μl，注射后7 d注射部位觸及小腫塊為建模成功。建模后小鼠隨機分為空白組以及苦參堿15、25、50、100 mg/kg組，每組均為10只小鼠。參照文獻[11]的方法，空白組小鼠瘤周皮下注射PBS；不同劑量苦參堿處理組小鼠瘤周皮下分別注射15、25、50、100 mg/kg苦參堿，1次/d，連續7 d。末次給藥2 h后，處死所有小鼠并剝離瘤體，稱取瘤體重量并測量其體積。
蘇木精-伊紅（HE）染色觀察小鼠腫瘤細胞形態變化。腫瘤組織置于含4%多聚甲醛中固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制作4 μm厚度的連續切片。HE染色，光學顯微鏡下觀察拍照。
1.4 統計學方法
采用SPSS22.0軟件行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 苦參堿使MuM2B細胞呈凋亡形態改變
透射電子顯微鏡觀察發現，對照組細胞結構正常，分布均勻，胞核、核仁較大，核仁不規則，細胞多為多邊形、圓形、梭形等；未見或少見核固縮。不同濃度苦參堿組隨濃度升高細胞核固縮逐漸增多，出現小片狀無細胞生長區，包漿濃縮，細胞形態明顯變化，胞質內出現較多大小不等的空泡（圖1）。
圖1
對照組、不同濃度苦參堿組細胞透射電子顯微鏡像（標尺：100 μm）
1A示對照組，可見核仁較大，邊界清晰，核染色質豐富；1B～1E分別示苦參堿0.25、0.50、1.00、2.00 g/L組，核仁變小，核濃縮，核染色質聚集，逐步分裂為碎片，形成凋亡小體
2.2 苦參堿降低MuM2B細胞增殖活性
MTT法檢測結果顯示，對照組、不同濃度苦參堿組不同作用時間（24、48、72、96 h）細胞存活率總體比較，差異有統計學意義（F=46.946、90.872、135.330、201.698，P=0.000）。其中，對照組與苦參堿0.25 g/L組不同作用時間（24、48、72、96 h）細胞存活率比較，差異均無統計學意義（t=0.365、0.205、0.299、0.202，P＞0.05）；與對照組比較，苦參堿0.50、1.00、2.00 g/L組細胞存活率隨苦參堿濃度升高及作用時間延長，細胞存活率逐漸降低，差異均有統計學意義（24 h：t=6.349、9.497、14.336；48 h：t=11.398、14.750、17.268；72 h：t=12.979、16.705、19.890；96 h：t=17.238、20.748、26.642；P＜0.05）（圖2）。
圖2
苦參堿不同濃度和作用時間對MuM2B細胞增殖的影響（n=3）
a同一作用時間，與對照組比較，
2.3 苦參堿阻滯MuM2B細胞周期并誘導細胞凋亡
流式細胞儀檢測結果顯示，對照組、不同濃度苦參堿組細胞周期總體比例比較，差異有統計學意義（F=54.833、35.823、25.011，P=0.000）。其中，與對照組比較，苦參堿0.25 g/L組細胞G0/G1期、G2/M期、S期細胞比例無顯著變化，差異無統計學意義（t=2.451、1.855、1.456，P＞0.05）；與對照組比較，苦參堿0.50、1.00、2.00 g/L組隨苦參堿濃度升高，G0/G1期細胞比例顯著升高（t=8.355、10.998、13.158，P＜0.05），G2/M期、S期細胞比例降低，差異均有統計學意義（G2/M期：t=4.732、7.088、8.768；S期：t=4.499、6.407、8.223；P＜0.05）（圖3）。
圖3
對照組與不同濃度苦參堿組細胞周期比例（n=3） a與對照組比較，P＜0.05；b與苦參堿0.25 g/L組比較，P＜0.05；c與苦參堿0.5 g/L組比較，P＜0.05；d與苦參堿1.00 g/L組比較，P＜0.05
對照組、不同濃度苦參堿組細胞凋亡率總體比較，差異有統計學意義（F=155.710，P=0.001）。其中，與對照組比較，苦參堿0.25、0.50、1.00、2.00 g/L組均隨苦參堿濃度升高，細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義（t=5.140、14.215、16.145、22.094，P＜0.05）（圖4）。
圖4
對照組與不同濃度苦參堿組細胞凋亡率比較（n=3）
a與對照組比較，
2.4 苦參堿可提高MuM2B細胞對放射線的敏感性
MTT法檢測結果顯示，同一照射劑量下，對照組、不同濃度苦參堿組細胞存活率總體比較，差異有統計學意義（F=47.071，P=0.000）。其中，與對照組比較，苦參堿0.25g/L組細胞存活率無顯著變化，差異無統計學意義（t=1.633，P＞0.05）；苦參堿0.50、1.00、2.00 g/L組隨苦參堿濃度升高細胞存活率顯著降低，差異有統計學意義（t=5.284、6.928、13.451，P＜0.05）（圖5）。
圖5
苦參堿對不同吸收劑量X線照射下MuM2B細胞存活率的影響（n=3）
2.5 苦參堿抑制MuM2B細胞增殖、凋亡相關基因表達
qRT-PCR檢測結果顯示，對照組、不同濃度苦參堿組細胞內CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量總體比較，差異有統計學意義（F=50.795、80.265、718.138，P=0.000）。其中，與對照組比較，苦參堿0.25 g/L組細胞中CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量無顯著變化，差異無統計學意義（t=2.118、1.837、3.008，P＞0.05）；與對照組比較，苦參堿0.50、1.00、2.00 g/L組隨苦參堿濃度升高，細胞中CyclinD（t=5.205、9.180、12.668）、Bcl-2（t=4.885、12.010、16.573）mRNA相對表達量逐漸降低，Bax（t=13.692、26.594、38.127） mRNA相對表達量逐漸升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖6）。
圖6
不同濃度苦參堿刺激濃度對細胞內CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA表達的影響（n=3） CyclinD：細胞周期蛋白D；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2；Bax：Bcl-2相關X蛋白；a與對照組比較，P＜0.05；b與苦參堿0.25 g/L組比較，P＜0.05；c與苦參堿0.5 g/L組比較，P＜0.05；d與苦參堿1.00 g/L組比較，P＜0.05
2.6 苦參堿抑制MuM2B細胞增殖、凋亡相關蛋白表達
Western blot檢測結果顯示，對照組、不同濃度苦參堿組細胞內CyclinD、Bcl-2、Bax 蛋白相對表達量總體比較，差異有統計學意義（F=20.945、35.116、34.067，P=0.000）。其中，與對照組比較，苦參堿0.25 g/L組細胞中CyclinD、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量無顯著變化，差異無統計學意義（t=0.490、0.680、1.386，P＞0.05）；與對照組比較，苦參堿0.50、1.00、2.00 g/L隨苦參堿濃度升高，細胞中CyclinD（t=2.976、5.495、7.746）、Bcl-2（t=4.254、6.725、10.376）蛋白相對表達量逐漸降低，Bax（t=5.347、7.733、9.122）蛋白相對表達量逐漸升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖7）。
圖7
不同濃度苦參堿對MuM2B細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響（n=3）
7A示電泳圖，A～E分別示對照組及苦參堿0.25、0.50、1.00、2.00 g/L組；7B示5組細胞內 CyclinD、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較 CyclinD：細胞周期蛋白D；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2；Bax：Bcl-2相關X蛋白；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶；a與對照組比較，
2.7 苦參堿抑制葡萄膜黑色素瘤體內生長
干預后，空白組及苦參堿15、25、50、100 mg/kg組小鼠腫瘤重量分別為（0.57±0.03）、（0.50±0.03）、（0.43±0.02）、（0.37±0.02）、（0.31±0.02）g；5組小鼠腫瘤重量總體比較，差異有統計學意義（F=176.333，P=0.000）。其中，與空白組比較，不同劑量苦參堿組小鼠腫瘤重量顯著降低，差異有統計學意義（t=5.217、12.279、17.541、22.804，P＜0.05）（圖8A，8B）。
圖8
不同濃度苦參堿對腫瘤的影響（n=10）
8A示空白組及苦參堿15、25、50、100 mg/kg組小鼠腫瘤大體標本；8B示5組小鼠腫瘤體量比較；8C示5組小鼠干預前后腫瘤體積比較 a與空白組比較，
干預前，空白組及苦參堿15、25、50、100 mg/kg組小鼠腫瘤體積分別為（71.84±3.49）、（72.85±3.40）、（71.22±3.28）、（70.62±3.06）、（70.41±3.40）mm3；5組小鼠腫瘤體積總體比較，差異無統計學意義（F=0.883，P＞0.05）。干預后，空白組及不同劑量苦參堿組小鼠腫瘤體積分別為（141.22±12.54）、（124.54±13.67）、（108.83±11.22）、（81.48±8.10）、（77.05±7.59）mm3；5組小鼠腫瘤體積比較，差異有統計學意義（F=63.837，P＜0.05）。其中，與空白組比較，不同劑量苦參堿組小鼠腫瘤體積顯著縮小，差異有統計學意義（t=2.843、6.087、12.655、13.844，P＜0.05）（圖8C）。
光學顯微鏡觀察發現，空白組腫瘤細胞彌漫分布，呈圓形、橢圓形或不規則形狀，排列紊亂緊密，細胞核染色加深，核漿比增大，核分裂相多見；不同濃度苦參堿組腫瘤細胞數量減少，細胞界限模糊，核固縮，分裂象減少，出現大片壞死（圖9）。
圖9
空白組及不同劑量苦參堿組腫瘤組織光學顯微鏡像（蘇木精-伊紅染色，標尺：50 μm）
9A示空白組，細胞排列紊亂緊密，形態不規則，細胞核深染；9B～9E分別苦參堿15、25、50、100 mg/kg組，細胞數量減少，核固縮，可見大片壞死
3 討論
葡萄膜黑色素瘤是一種死亡率極高的惡性腫瘤，細胞惡性增殖、侵襲是導致疾病難以根治以及患者預后較差的根本原因[12]。目前其治療方式主要為放射治療，但由于葡萄膜黑色素瘤細胞增殖與侵襲能力較強，導致治療效果較差，影響患者生存質量。研究發現，癌細胞中多種生長因子均會對細胞放射線敏感性造成影響，如細胞增殖因子、凋亡因子等，最終導致患者死亡率高、生存率低以及預后差[13-14]。
中藥具有安全性高、價格低廉以及副作用低等特點，可通過多種途徑抑制腫瘤細胞增殖、轉移，降低腫瘤發生率[15]。有研究發現，木犀草素可抑制葡萄膜黑色素瘤中血管生成，發揮抗葡萄膜黑色素瘤作用[16]；小白菊內酯可抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖，誘導凋亡[17]。石蒜堿可引起葡萄膜黑色素瘤細胞S期阻滯，誘導細胞凋亡，從而發揮抗癌作用[18]。苦參堿作為一種臨床應用價值較高的中藥活性成分，在抗腫瘤中發揮著重要作用，能夠通過抵抗細胞周期進展，抑制細胞增殖以及誘導細胞凋亡等過程抑制腫瘤發生與發展，還可與其他放射治療（放療）、化學藥物治療（化療）藥物聯合使用，協同發揮抗腫瘤作用以及提高腫瘤細胞的放療敏感性，以發揮更好的治療效果[19-21]。前期研究表明，苦參堿在眼底疾病中具有一定作用，通過抑制血管內皮細胞增殖，改善糖尿病視網膜病理損傷[22]。
細胞持續不斷的分裂與增殖是腫瘤細胞進展迅速的重要原因之一，因此抑制細胞增殖，并誘導細胞凋亡是臨床治療惡性腫瘤的主要目的之一[23]。細胞凋亡是指程序性細胞絲死亡Bcl家族蛋白是常見的凋亡蛋白之一，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，當Bcl-2水平降低，Bax水平升高，細胞趨向凋亡[24]。CyclinD主要見于一些原發性惡性腫瘤，并在癌細胞中高表達，調節細胞周期，促進細胞增殖，臨床上常用于腫瘤早期診斷與預后診斷[25]。本研究結果顯示，不同濃度苦參堿處理后，MuM2B細胞形態改變，出現大量核固縮，存活率降低，凋亡率升高，G0/G1期細胞比例升高，G2/M期、S期細胞比例降低，CyclinD、Bcl-2表達顯著降低，Bax水平升高，表明苦參堿可通過下調CyclinD、Bcl-2表達，增加Bax表達，降低MuM2B細胞的存活率，提高凋亡率，且具有劑量效應，提示苦參堿具有抑制MuM2B細胞增殖、阻滯細胞周期進展并誘導凋亡的作用。本研究結果與史雪麗等[26]報道的馬錢子堿通過改變線粒體凋亡途徑中凋亡相關信號分子Bax及Bcl-2的表達，抑制黑色素瘤細胞增殖并促進細胞凋亡的結論具有一致性。
常規放療主要是通過促進腫瘤細胞重新氧合、細胞周期重新分布過程實現的，但在放療過程中部分腫瘤細胞會產生一定的放療抵抗性并進一步克隆增生更多的放療耐受細胞[27-28]。本研究結果顯示，不同濃度苦參堿處理后，細胞存活率降低，表明苦參堿處理后，MuM2B細胞對放療的敏感性增加，且具有劑量效應，提示苦參堿可有效增強MuM2B細胞的放療敏感性。另外，本研究體內實驗結果顯示，苦參堿可顯著抑制腫瘤生長，這與Zhang等[29]研究結果一致，表明苦參堿可抑制葡萄膜黑色素瘤生長。
本研究通過設置不同濃度的苦參堿處理MuM2B細胞，探討其對MuM2B細胞增殖、凋亡和放療敏感性的影響，發現苦參堿能夠有效抑制MuM2B細胞增殖、阻滯細胞周期并誘導其發生凋亡，增強其放療敏感性，為今后開發葡萄膜黑色素瘤新的治療藥物和放化療輔助藥物提供了新思路。
本研究存在的不足是苦參堿發揮抗葡萄膜黑色素瘤的主要成分和具體機制仍需進行深入研究；細胞增殖、凋亡機制復雜，涉及多條信號通路，本研究對細胞增殖、凋亡等相關蛋白表達的研究過于單一，今后研究尚需要進一步補充和完善。
